Правила отбора проб воды

1. Отбор и предварительная обработка образцов почвы

При определении степени загрязнения почвы промышленными источниками места для отбора проб располагают на площади трёх­кратной величины санитарно-защитной зоны вдоль вектора розы ветров на расстоянии 100, 200, 300, 1000, 5000 м и более от источника загрязнения (ГОСТ 17.4.4.02-84).

При контроле состояния почв в районе точечных источников загрязне­ния пробные площадки размером 5x5 м закладывают на разном расстоя­нии от источника и в относительно чистом месте (контроль). На каждой из выбранных площадок пробы отбирают «по правилу конверта» (четыре пробы по углам участка и одну в центре). В месте отбора пробы выкапыва­ют шурф размером 0,3x0,3 м и глубиной 20 см. Для этой цели используют почвенный бур Некрасова. Поверхность одной из стенок шурфа зачищают стерильным ножом и вырезают из этой стенки почвенный обра­зец массой 200 г, что обычно составляет пласт размером 20x3x3 см.

При определении степени загрязнения почв химическими вещес­твами, пробы отбирают поверхностно (0-1 см) стерильным инстру­ментом (ножом, шпателем) в количестве 0,3-0,5 кг.

При оценке почв сельхоз территорий пробы отбираются два раза в год (весной и осенью) с глубины 0-25 см. На каждые 0-15 га закладывают не менее одной площадки размером 100-200 м² в зависимости от рельефа местности и условий землепользования. Применяемые для работы инструменты перед взятием каждого нового образца стерилизуют.

Все отобранные образцы собирают в отдельные промаркированные пакеты, изготовленные из специальной бумаги «Крафт» или стерильные емкости, которые после заполнения закрывают пробками с бумагой и немедленно доставляют в лабораторию для анализа. Допускается хранение образцов до начала исследования при температуре 4-5 °С не более 24 ч.

В лаборатории из 5 точечных проб почвы, взятых с одного участка, готовят усреднённую пробу массой около 500 г, тщательно перемешивая и растирая образцы в стерильной фарфоровой чашке резиновым пестиком в течение 5 мин. Посторонние примеси (корни растений, камни, щепки) удаляют путём просеивания почвы через сито, которое предварительно протирают ватным тампоном, смоченным 96% этиловым спиртом.

Из усреднённой пробы отбирают навески (от 1 до 50-55 г в зависимости от определяемых показателей) и готовят суспензию 1:10 на стерильной водопроводной воде (10 г почвы на 90 см³ воды). Для десорбции микроорганизмов с поверхности почвенных частиц приготовленную почвенную суспензию встряхивают в течение 3 мин на мешалке механического диспергатора. После отстаивания суспензии в течение 30с готовят последовательные 10-кратные разведения почвы до концентрации 10^-4-10^-5 г/см³.

2. Определение общего количества бактерий в почве

Посев проводят в 1,5% МПА – не менее двух различных разведений пробы в зависимости от степени предполагаемого загрязнения исследуемой почвы. Перед посевом каждое разведение тщательно перемешивают стерильной пипеткой, забирают 1 см³ суспензии и переносят на дно стерильной чашки Петри. Из каждого разведения посев проводят минимум в две параллельные чашки. После этого в чашки вливают 15-20 см³ предварительно расплавленного и остуженного до температуры 45 °С питательного агара, тщательно перемешивают с почвенной суспензией и оставляют до застывания в строго горизонтальном положении. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат в перевёрну­том виде (крышкой вниз) при температуре 37 °С на 24 ч. После инкубации подсчитывают выросшие колонии и проводят пересчёт на 1 г почвы.

3. Определение бактерий группы кишечных палочек

3.1. Бродильный (титрационный) метод

При анализе почвы с невысокой степенью фекального загрязнения рекомендуют проводить определение БГКП титрационным методом с использованием среды Кесслер или лактозного бульона с трифенилтетразолием хлорида (ТТХ). 10 см³ почвенной суспензии первого разведения (1:10) засевают во флакон с 50 см³ среды, что соответствует посеву 1 г почвы. Последующие разведения высевают по 1 см³ в пробирки с 9 см³ той же среды. Перед посевом в каждую пробирку с лактозным бульоном добавляют 0,3 см³ 2% водного раствора ТТХ, а в каждый флакон – по 1,5 мл.

Методика посева с использованием ТТХ основана на способности кишечной палочки восста­навливать бесцветное соединение ТТХ в трифенилформазан, выпадающий в осадок, придающий среде коричнево-красный цвет. Кишечная палочка устойчива к действию формазана, в то время как развитие другой микро­флоры подавляется. Посевы на среде Кесслер-Свенертона инкубируют 48 ч при температуре 43 или 37 °С. Отсутствие через 48 ч газообразования и помутнения в бродильных сосудах позволяет дать отрицательное заключение о наличии БГКП. Отрицательное заключение при использовании лактозного бульона с ТТХ дают через 24 ч в том случае, если в пробирках и флаконах цвет среды не изменился. При наличии признаков бактери­ального роста проводят высев на среду Эндо или розоловый агар. Чашки с посевами инкубируют при температуре 37 °С 24 ч. В случае отсутствия при­знаков роста на чашках дают отрицательное заключение. Красные, розовые с металлическим блеском, жёлтые и оранжевые колонии на розоловой среде типичны для кишечных палочек.

На заключительном этапе исследования проводят идентификацию выросших на агаризованных средах характерных колоний (аналогично анализу БГКП в воде). Результаты анализа выражают коли-титром.

3.2. Метод мембранных фильтров

Данный метод используют в качестве ускоренного метода анализа слабозагрязнённых почв. Через стерильные мембранные фильтры № 3 с помощью фильтровального аппарата Зейтца пропускают 5–10 см³ почвенной суспензии первого разведения, которую предварительно центрифугируют при 2000 об./мин в течение 5 мин. Дальнейшее исследование проводят аналогично анализу БГКП в воде методом мембранных фильтров.

3.3. Прямой поверхностный посев на плотные питательные среды

Этот метод применяют для исследования почвы из мест интен­сивного фекального загрязнения. Проводят прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,05 см³на среды Эндо. При анализе сравнительно чистых почв посев проводят из раз­ведений 1:10-1:100, для загрязнённых почв используют разведение 1:10⁶. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 °С в тече­ние 24 ч. На следующем этапе исследования идентифицируют выде­ленные бактерии (аналогично определению БГКП в воде).

Результаты двух последних методов исследований выражают коли-титром или коли-индексом.

4. Определение перфрингенс-титра

4.1. Посев почвенных разведений в среду Вильсона-Блера

Из всех почвенных разведений (до 1:10⁶) образцы по 1 см³ перено­сят в 2 параллельных ряда пробирок. Один ряд пробирок прогревают при температуре 80 °С в течение 15 мин и/или при 90 °С – 10 мин. Затем во все пробирки добавляют по 9-10 см³ свежеприготовленной среды Вильсона-Блера. Инкубацию посевов проводят при температуре 37 или 43 ⁰С в течение 24 ч. Учёт можно проводить и несколько раньше, так как санитарно-показательные клостридии, преимущественно С. perfringens, через несколько часов образуют колонии чёрного цвета. Обнаружение в мазках колоний характерных грамположительных палочек указывает на наличие С. perfringens. Общепринятая методика определения С. perfringens на среде Вильсона-Блера имеет существенный недостаток – питательная среда в определённой степени ингибирует рост микроорганизма. Для устранения этого явления предложена модификация методики.

4.2. Использование сред накопления для определения

клостридий в почве

По 1 см³ прогретых и нативных почвенных разведений засевают в про-бирки с полужидкими и жидкими питательными средами, предварительно регенерированными кипячением (Клодницкого, Китт-Тароцци, бульона Мартена с ватой и др.). После инкубации посевов в течение 18-20 ч при температуре 37 °С проводят высев 0,5-1 см³ материала из помутневших пробирок в среду Вильсона-Блера или сульфит-полимиксин-неомициновую среду. Посев, инкубацию и учёт при этом проводят аналогично первому способу.

5. Определение термофильных бактерий

Учёт термофильных сапрофитных микроорганизмов производят на МПА, который разливают толстым слоем. Посев проводят из разведений 1:10-1:10⁶ в 2-3 параллельные чашки Петри. Учёт проводят после инкубации в течение 24 ч при температуре 60 °С аналогично, как при определении общего количества бактерий в почве.

6. Определение нитрифицирующих бактерий

Для определения нитрифицирующих бактерий сеют почвенные разведения во флаконы с минеральной средой Виноградского, разлитой тонким слоем. В ходе эксперимента два флакона со средой оставляют незасеянными в качестве контроля чистоты среды. Посевы инкубируют при температуре 28 °С в течение 14-15 сут. При развитии нитрифицирующих бактерий в среде образуются азотистая и азотная кислоты, которые определяют на 5-7 сутки после посева и вторично – на 14-15. Титр нитрифицирующих бактерий определяют качественной реакцией с дифениламином, который в присутствии азотистой и азотной кислот даёт синее окрашивание. Пастеровской пипеткой несколько капель среды из каждого флакона, не взмучивая осадок, переносят на стеклянную или фарфоровую пластинку, добавляют несколько капель дефениламина, разведённого концентрированной серной кислоте. Синее окрашивание указывает на присутствие в среде продуктов метаболизма нитрифицирующих бактерий. Среда контрольных флаконов должна оставаться без изменения окраски.

Заключение _________________________________________________

Контрольные вопросы

Как отбирают образцы почвы для исследований?

Как формируется усредненная проба образцов почвы?

Как определяется ОКБ в почве?

Какие методы используются для определения БГКП в почве?

В чем сущность бродильного метода определения БГКП?

В каких случаях используется прямой поверхностный посев почвы на плотные питательные среды?

Что такое перфрингенс-титр?

Какими методами определяется перфрингенс-титр?

Какие питательные среды используют для определения перфрингенс-титра?

Какие среды накопления используют для определения клостридий в почве?

Какие микроорганизмы называют термофильными?

Каким образом определяют термофильные бактерии в почве?

Какую питательную среду используют для определения нитрифицирующих бактерий?

Какие СПМО почвы вы знаете?

Какие микроорганизмы попадают в почву с выделениями человека и животных и дольше всех в ней сохраняются?

Какие показатели определяют при санитарном анализе почвы?

Какую роль в почве выполняют аммонификаторы и нитрификаторы?