Санитарно-микробиологическое исследование воды централизованногохозяйственно-питьевого водоснабжения.

1. Знакомство с правилами отбора, хранения и

транспортировки проб воды

Демонстрация посуды и емкостей, разбор правил отбора, хранения и транспортирования проб воды для микробиологического исследования.

2. Определение общего числа микроорганизмов (ОМЧ)

Разбор нормируемых микробиологических показателей качества воды: общее микробное число (ОМЧ), общие колиформные бактерии (ОКБ), термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ), коли-фаги.

а) Определение ОМЧ (разбор схемы)

Для определения ОМЧ воды чаще всего используют метод 10-кратных разведений, когда концентрация микроорганизмов каж­дого последующего разведения в 10 раз меньше предыдущего, затем разведения высевают на питательные среды. В пустые стерильные чашки Петри, соблюдая правила асептики, стерильной пипеткой вносят 1 см³ из заранее приготовленного разведения. Чашки предварительно маркируют (со стороны донышка, а не крышки!), чтобы исключить случайную замену их при падении, сдвиге и др.

Разведения выбирают с таким расчётом, чтобы на чашке выросло от 30 до 300 колоний. Из каждой пробы засевают два разведения. Не позднее чем через 15 мин после внесения материала (разведения) в чашку наливают расплавленного и остуженного до 45⁺5 °С 10-12 см³ питательного агара (питательную среду), толщина слоя которого должна быть 4-5 мм. Расплавленную среду и посевной материал незамед­лительно тщательно перемешивают круговыми движениями, чтобы микроорганизмы равномерно распределились в массе среды. Чашки Петри оставляют на холодной горизонтальной поверхности на 10-15 мин для охлаждения и застывания среды, после чего посевы помещают в термостат и инкубируют при заданной температуре и экспозиции.

Для дальнейшей работы выбирают чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний, а при посеве нативного материала - от 1 до 300 колоний. Количество колоний на поверхности и в глубине агара подсчитывают визуально или при помощи лупы с 2-5-кратным увеличением.

б) Определение ОКБ и ТКБ титрационным методом

Метод основан на накоплении бактерий после посева определенных объемов воды в жидкие питательные среды, с последующим пересевом на дифференциальную плотную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам. При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санэпиднадзор) засевают три объема по 100 см³. При исследовании воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ (повторный анализ) засевают соответственно 100, 10 и 1 см³ - по три объема каждой серии.

Посевы 10 и 100 см³ воды проводят соответственно в 1 и 10 см³ среды накопления - концентрированной ЛПС без индикатора. Посев 1 см³ пробы проводят в 10 см³ ЛПС обычной концентрации. Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 48 ч. Через 24 ч проводят предварительную оценку посевов в среде накопления. Из ёмкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа, материал высевают бактериологи­ческой петлёй на сектора среды Эндо для получения изолированных коло­ний. Ёмкости без видимых признаков роста и образования газа оставляют в термостате до 48 ч и ещё раз просматривают для окончательной оценки.

Результаты посевов без признаков роста считают отрицательными, и дальнейшему изучению они не подлежат. Из ёмкостей, где отмечены помут­нение и образование газа (или только помутнение), делают высев на сектора среды Эндо. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре 37 °С 18-20 ч. При появлении помутнения, образовании газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бак­терий (тёмно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде), дают положительное заключение о присутствии ОКБ в данном объёме пробы.

Наличие ОКБ необходимо подтвердить в следующих случаях:

· в среде накопления отмечено только помутнение;

· принадлежность к лактозоположительным колониям вызывает сомнение.

Для подтверждения присутствия ОКБ выполняют следующие действия:

· проверяют наличие отпечатка на среде Эндо после снятия петлёй подозрительной колонии;

· выполняют оксидазный тест;

· проверяют принадлежность к группе по Граму;

· подтверждают способность к газообразованию при посеве 1-2 изоли­рованных колоний всех типов с каждого сектора в среду подтвержде­ния (ЛПС с индикатором) с последующей инкубацией посевов при температуре 37 °С в течение 24-48 ч.

При отсутствии изолированных колоний проводят рассев на среду Эндо общепринятыми бактериологическими методами. Отрицательное заключение дают, если:

· в среде накопления нет признаков роста;

· на секторах среды Эндо нет роста;

· на секторах среды Эндо выросли нехарактерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные, с неровными краями, расплывчатые);

· все колонии оказались оксидазоположительными;

· все колонии оказались грамположительными;

· в подтверждающем тесте на среде ЛПС с индикатором не отме­чено газообразования.

Для определения ТКБ работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии. Делают посев двух-трёх изолированных колоний каждого типа из каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред накопления, инкубируют при температуре +44 °С течение 24 ч. При образовании газа в лактозной среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности к ферментации лактозы до кислоты и газа в подтверждающих лактозных средах при температуре 44 °С в течение 24 ч дают положитель­ное заключение о наличии в этом объёме воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательное заключение.

в) Определение ОКБ и ТКБ методом мембранных фильтров

Метод основан на фильтровании определенных объемов воды через мембранные фильтры. Для этих целей используют фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером 35 или 47 мм в диаметре (отечественные фильтры «Владипор» МФАС–С–1, МФАС–С–2, МФАС–МА (№ 4-6) или зарубежные – ISO 9000 или EN 29000). При исследовании воды неизвестного качества для получения изолированных колоний фильтруют следующие объёмы воды: 10, 40, 100 и 150 см³ соответственно на 4 фильтра. Далее фильтры помещают на чашки со средой Эндо и инкубируют при 37°С или 44°С в течение 24 ч. Если на фильтрах нет роста колоний или отмечен рост плёнчатых, губчатых, плесневых, прозрачных или расплывчатых колоний, то выдаётся отрицательный ответ.

При наличии подозрительных колоний (S- или R- тип, лактозоположительные) ставят тест на оксидазу, окрашивают по Граму, проводят посев на жидкую лактозо-пептонную среду (ЛПС).