Гуморальные факторы и методы их определения

Наряду с клеточными реакциями неспецифической резистентности в процессе эволюции возник ряд веществ, находящихся в коллоидно-растворимом состоянии или же выделяющихся в жидкие среды организма. Эти вещества осуществляют функцию первичной защиты от чужеродных антигенных и неантигенных частиц.

Количество этих гуморальных факторов значительно. К числу более активных, или наилучшим образом изученных, следует отнести нормальные антитела, лизоцим, комплемент, пропердин, лейкины, b-лизины и др.

Нормальные антитела

В сыворотке людей и животных выявляются нормальные антитела против различных микробных антигенов. Они обладают агглютинирующим, комплементсвязывающим, литическим, нейтрализующим влиянием на микробные антигены. Вопрос о природе так называемых неспецифических иммуноглобулинов сыворотки до сих пор не решен. Между тем сыворотка крови может содержать иммуноглобулины даже по отношению к антигенам, о которых заведомо известно, что они никогда не поступали в данный организм. Такие антитела получили название естественных или «нормальных». Они обычно определяются в низких титрах, однако их иммунологическая роль довольно выражена, особенно по отношению к инфекционным агентам.

Считается, что нормальные антитела появляются в результате так называемой неприметной иммунизации возбудителями или антигенами, поступающими с пищей, однако нельзя отрицать и спонтанный (генетически обусловленный) механизм их образования.

Реакции антител по отношению к антигенам, о которых заведомо известно, что они не проникали в данный организм, могут расцениваться и как перекрестные, отсюда и их более низкие титры. Нормальные антитела могут поступать трансплацентарно или с молоком матери. Их титр определяется серологическими реакциями (РНГА, РСК и др.) и обычно равен. 1:5 — 1:20.

B-лизины

Многие сыворотки проявляют бактерицидное действие по отношению к грамположительным, главным образом, спорообразующим бактериям и микрококкам. Эта активность не связана с комплементом и сохраняется после прогревания сыворотки при 60—65 °С в течение 30 мин. Характерно, что b-лизины обнаруживаются в сыворотке после образования свернутого сгустка цельной крови и не обнаруживаются в плазме. Считается, что b-лизины выделяются в процессе свертывания крови тромбоцитами.

Бактерицидное действие b-лизинов, по-видимому, обусловлено их влиянием на цитоплазматическую мембрану, в результате чего наступает аутолиз клеточной стенки ферментами цитоплазматической мембраны. b-лизины активны только в присутствии ионов Са⁺⁺.

Для определения b-лизинов в нормальной сыворотке человека необходима спорообразующая культура сенной палочки. 'Готовят микробную взвесь, добавляют к 0,4 мл взвеси 0,2 мл исследуемой сыворотки. В контроле к 0,4 мл взвеси добавляют 0,2 мл физиологического раствора. Замеряют оптическую плотность опытной и контрольной пробирок, помещают в термостат при 37 °С на 2 часа. Вновь замеряют оптическую плотность. Расчет активности b-лизинов проводят по формуле:

Процент лизиса =

Д1­– Д2 Д1

* 100 % ,

где Д₁ и Д₂ – оптическая плотность в опыте до и после инкубации.

Для определения титра b-лизинов готовят разведения исследуемой сыворотки в мясо-пептонном бульоне. Затем во все пробирки добавляют взвесь суточной культуры сенной палочки, инкубируют в термостате 24 часа. Определяют титр b-лизинов – наибольшее разведение сыворотки, давшее полный лизис тест-культуры.

Комплемент

Комплемент представляет собой систему сывороточных белков. Известно не менее 18 белков, составляющих систему комплемента. Восемь из них являются индивидуальными белками, а один представляет комплекс: 4 белка системы пропердина, один — ингибитор фермента активатора. Согласно номенклатуре, принятой ВОЗ, система комплемента обозначается символом С, а ее индивидуальные компоненты символами Cl, C2 и т. д.

Каждая белковая фракция обладает определенными свойствами. Комплемент находится в сыворотке крови различных животных и человека, но наибольшее его количество обнаружено в сыворотке крови морских свинок, поэтому в практике препарат «комплемент» отождествляется с сывороткой морской свинки. В норме фракции комплемента находятся в неактивном состоянии. Они становятся активными в процессе многоступенчатых превращений, разделяемых на классический и альтернативный пути активации.

При классическом пути начальным активатором комплемента является комплекс антиген-антитело. Активируют систему комплемента IgM и большинство подклассов IgG (IgG1, 3) в большей степени, IgG2 — в меньшей.

При альтернативном пути активаторами являются полисахариды, в том числе зимозан и инулин, липополисахариды (эндотоксины), агрегаты – IgA. Дальнейший ход активации аналогичен классическому пути. (Схема 2)

В активном состоянии комплемент участвует в специфических иммунологических реакциях организма, при бактериолизе, ускоряет специфическую агглютинацию, преципитацию, усиливает, фагоцитоз, участвует в реакциях нейтрализации.

Активированные компоненты комплемента действуют в определенном порядке — в виде каскада ферментов, при этом продукт предшествующей реакции служит катализатором для включения в последующую реакцию компонента и субкомпонента. Комплемент является важным фактором гомеостаза и регулируется механизмами последнего.

Комплемент отличается от иммуноглобулинов тем, что его концентрация в сыворотке крови не повышается в результате иммунизации.

Содержание и уровень комплемента в крови можно использовать как тест, характеризующий состояние естественной резистентности макроорганизма: высокое содержание комплемента в крови считается благоприятным признаком; снижение уровня комплемента является отрицательным прогностическим показателем.

Для определения титра комплемента исследуемую сыворотку разводят и добавляют гемолитическую систему (смесь равных объемов эритроцитов барана и гемолитической сыворотки).

Таблица 10

Схема титрования комплемента

Пробирки инкубируют при 37°С 30 минут, встряхивая каждые 10 минут (табл. 10). Для контроля готовят разведения эритроцитов и дистиллированной воды: 0,1мл + 2,9мл (соответствует 20% гемолизу); 0,25мл + 2,75мл (соответствует 50% гемолизу); 0,35мл + 2,65мл (соответствует 70% гемолизу).

После инкубации содержимое пробирки центрифугируют при 1500 об/мин 5 минут и определяют пробирку, соответствующую 50% гемолизу. Количество комплемента, внесенное в эту пробирку, делят на исходное разведение и узнают какое количество неразведенной сыворотки дает этот феномен. Эта величина будет соответствовать 1 единице СН₅₀. Вычисляют, сколько таких единиц будет в 1 мл неразведенной сыворотки.

Схема 2. Пути активации и физиологические функции компонентов

комплемента

Классический путь Комплекс АГ – АТ (IgG, IgM)

Альтернативный путь липополисахарид, IgА

С1 С4в 2а Са++ Mg++

В (протеиназа, образует комплекс С3вВ) Р (стабилизатор комплекса С3вВ) Д (активатор С3вВ в С3вВв)

С3

Иммунное прилипание, фагоцитоз

С3в

С3а

С5

С5а

тучная клетка, базофил, тромбоцит

гистамин, брадикинин, серотонин, лейкотриены

Острое воспаление, расширение кровеносных сосудов, транссудация

С5в

С6

С7

С8

С9

С5, 6, 7 несвязанный комплекс

хемотаксис, фагоцитоз, активация лизосом

Лизис мембраны

Мембраноатакующий комплекс

МАК

Пропердин

В 1954 году Л. Пилломер обнаружил сывороточный фактор, который, как тогда считалось, активирует С₃ и является центральным звеном альтернативного пути активации комплемента. Он был назван пропердином. Вскоре были обнаружены еще два дополнительных сывороточных белка – В и D. Вместе с компонентами комплемента С₅ – С₉ они были объединены в пропердиновую систему. Действительная роль пропердина (Р) в альтернативном пути активации оказалась иной. Он является стабилизатором комплекса С_3ВВ (схема3).

Схема 3. Роль пропердина в альтернативном пути активации комплемента

Усиление образования С3в за счет расщепления С3

ЛПС

С3

С3в

С3а

С3в + В

В

P – стабилизатор комплекса С3вВ Д – фермент-активатор комплекса С3вВ. Образуется С3вВв, являющийся конвертазой для С5

Первичный

Фактор В – протеиназа, Мм – 95 кD,

Фактор D – гликопротеин, Мм – 25 кD,

Фактор Р – g-глобулин, Мм – 220 кD.

Тем не менее, содержание пропердина в сыворотке крови в определенной степени, коррелирует с уровнем ее бактерицидной активности. В силу этого определение содержания пропердина в сыворотке крови больных продолжает использоваться в практике.

О количестве пропердина в испытуемой сыворотке судят по степени сорбции комплемента на комплексе зимозан-пропердин. Чем больше в сыворотке пропердина, тем интенсивнее будет связываться этим комплексом комплемент.

Методика: опыт ставится в двух пробирках. Опытная содержит испытуемую сыворотку, зимозан и комплемент. Контрольная — только испытуемую сыворотку и комплемент. Пробирки инкубируют при 37°С 60 мин. Далее в обеих пробирках по общепринятой методике титруют комплемент. Титр комплемента в контрольной пробирке показывает, какое количество комплемента было в опытной пробирке до образования комплекса пpoпердин-зимозан. Титрование же комплемента в опытной пробирке показывает какое количество осталось несвязанным после образования этого комплекса. По разнице полученных единиц можно судить о количестве комплемента, связанного комплексом пропердин—зимозан. За одну единицу пропердина принимается его количество, которое полностью связывает весь комплемент в 1 мл сыворотки.

Лизоцим

По химической структуре лизоцим относится к полипептидам, содержащим в молекуле около 130-160 аминокислотных остатков. Он растворим в слабокислой среде, устойчив к непродолжительному кипячению, к трипсину.

Лизоцим (мурамидаза) способен расщеплять основное вещество клеточной стенки бактерии муреин путем разрушения связи между первым углеродным атомом n-ацетилмурамовой кислоты и четвертым углеродным атомом n-ацетилглюкозамина, входящего в состав клеточной стенки бактерий. В результате этого изменяется ее проницаемость.

Лизоцим является мощным защитным фактором слизистой оболочки полости рта, глаза, содержится в слезах, слюне, крови, материнском молоке, тканях различных внутренних органов. Высокая концентрация лизоцима выявляется в околоплодных оболочках и водах плода.

Основная масса лизоцима синтезируется, по-видимому, тканевыми макрофагами и нейтрофилами.

Лизоцим выполняет в организме важные биологические функции: бактерицидное действие, стимулирующее воздействие на фагоцитоз, способность нейтрализовать некоторые микробные токсины, а также противовоспалительное действие.

Наибольший литический эффект лизоцим оказывает на культуру микрококка (in vitro). Действие лизоцима можно оценить фотометрически по уменьшению оптической плотности суспензии микрококка.

Методика. Готовят исходный раствор кристаллического лизоцима 100 мг/мл, а из него 9 различных разведений.

Все разведения как лизоцима, так и бактерий, делают на 1/15 М фосфатном буфере, рН=6,2 (табл. 11).

Для приготовления взвеси бактерий смывают буферным раствором со скошенного агара суточную культуру микрококка и стандартизируют его на ФЭК-М по левому барабану до оптической плотности 0,66.

Таблица 11

Схема титрования лизоцима

В каждую пробирку с приготовленными разведениями лизоцима вносят по 2 мл взвеси микрококка и выдерживают при 37°С 30 мин в термостате. Замеряют оптическую плотность на ФЭК-М по правому барабану в кювете № 2 с зеленым светофильтром. На основе полученных данных строят калибровочную кривую.

Для определения количества лизоцима исследуемый материал в объеме 0,1 мл добавляют к 0,4 мл буфера и к полученной смеси приливают 2 мл стандартизованной смеси микрококка. Контролем является пробирка, не содержащая исследуемого материала. Инкубируют в термостате 30 минут при 37°С и на ФЭК-М определяют оптическую плотность в опытной и контрольной пробирках. По калибровочной кривой устанавливают концентрацию лизоцима в исследуемом материале.