Воспаление. Фагоцитоз

При воздействии на организм многообразных повреждающих факторов физической, химической и биологической природы возникает сложная неспецифическая защитно-приспособительная реакция организма — воспаление. Воспаление — местная реакция кровеносных сосудов, соединительной ткани и нервной системы на повреждение. В процесс воспаления вовлекаются лимфатические структуры, сосудистая сеть и локально повреждаемые ткани. Сначала нарушается обмен жидкости, что ведет к нарушению циркуляции в капиллярах. Одно из серьезных изменений — повышение проницаемости капилляров.

Итогом воспалительной реакции является локализация микроорганизмов (или отграничение вызванного ими очага поражения) с последующей их элиминацией и частичным или полным восстановлением нарушенных структур.

Первым звеном воспалительной реакции являются сосудистые изменения, выражающиеся прежде всего в повышении проницаемости стенки сосудов, связанной, главным образом, с действием биологически активных веществ (гистамин, серотонин, кинины), выделяющихся при повреждении клеток, особенно тучных. Повышение сосудистой проницаемости ведет к периваскулярной экссудации плазмы («серозный отек») и обусловливает миграцию клеток-фагоцитов (нейтрофилы, макрофаги) в пораженные участки ткани.

Указывают на роль воспалительного отека (скопление экссудата в воспалительной ткани) как фактора, способного связывать, фиксировать бактериальные токсины в очаге воспаления и не допускать их всасывания и распространения в организме. Особенно большое защитное значение имеют фагоцитарная и пролиферативная функции клеток – гистиоцитов, макрофагов. Грануляционная ткань, которую они образуют, представляет мощный защитный барьер против инфекции.

Фагоциты могут быть причислены к главным факторам воспаления. Особую роль при этом играют тканевые макрофаги, обладающие способностью поглощать и переваривать различные чужеродные для организма агенты, включая микроорганизмы. Защитные свойства фагоцитов связаны с наличием в их цитоплазме большого числа лизосом - органелл, богатых различными гидролитическими ферментами, обеспечивающими расщепление значительного числа химических связей. Процесс фагоцитоза нередко сопровождается гибелью клетки-фагоцита, однако при этом происходит гибель большого числа микроорганизмов.

Фагоцитоз — общебиологическое неспецифическое явление, которое может быть отнесено филогенетически к высокому уровню распознаваемости чужеродности. Фагоцитирующие клетки мезенхимы приобрели в процессе эволюции определенную специализацию и стали поглощать широкий спектр посторонних частиц, таких, как микроорганизмы, макромолекулярные комплексы aнтиген-антитело, клетки и их органеллы, вирусы, коллоидальные растворы красок и др. Важнейшее свойство фагоцитов состоит в их способности распознавать «не свое», что ставит, эту реакцию на переходную ступень между неспецифической резистентностью н специфическим иммунитетом.

Клетки, обладающие способностью к фагоцитозу и пиноцитозу, подразделяют на две основные категории фагоцитов — мононуклеарные и полинуклеарные («макрофаги» и «микрофаги» по И. И. Мечникову).

Процесс фагоцитоза протекает в несколько ступеней. На первой стадии распознавания основную роль играет клеточная мембрана, которая благодаря своим рецепторам (Fc—рецепторы) обеспечивает контакт с объектом фагоцитоза. Погружение чужеродной частицы внутрь макрофага связано со сложными изменениями физико-химических свойств его цитоплазмы. Вначале актиноподобный белок макрофага полимеризуется, а затем полимеры сокращаются под действием миозина с кофактором. В итоге образуются псевдоподии, захватывающие фагоцитируемую частицу. Фагоцитирующая вакуоль (фагоцитируемый агент, окруженный плазматической мембраной фагоцита и погруженный внутрь цитоплазмы) соприкасается с лизосомальными гранулами фагоцита. При слиянии вакуоли с лизосомами образуется фаголизосомальная (пищеварительная) вакуоль. Через непродолжительное время в вакуоли может наступить гибель захваченной частицы (например, бактерии). Этому способствуют метаболиты фагоцита и лизосомальные ферменты (завершенный фагоцитоз).

Микробоцидную деятельность осуществляет молочная кислота, образующаяся в результате гликолиза и понижающая внутривакуольный рН до 4,0, затем перекись водорода, являющаяся результатом окисления никотиндиамид-адениннуклеотида в редуцированном фосфорилированном состоянии. Лизосомы содержат в себе более тридцати различных ферментов, способных гидролизировать большую часть захваченных объектов. В гранулах лейкоцитов найдены и другие микробоцидные вещества, например, катионные белки, лактоферрин, различные пероксидазы, активные также в отношении и вирусов.

Однако, не во всех случаях происходит гибель, а ряд возбудителей могут даже размножаться в фагоците и погубить его (незавершенный фагоцитоз).

Доступность клеток для определения фагоцитарной активности микрофагального (нейтрофилы) или макрофагального (моноциты) фагоцитоза представлена на схеме 1.

Схема 1. Локализация фагоцитирующих клеток и их доступность для исследования.

Для оценки фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови к цитратной крови, взятой из пальца, в объеме 0,2 мл, добавляют 0,25 мл взвеси микробной культуры с концентрацией 2 млрд. микробов в 1 мл. Смесь инкубируют 30 мин при 37°С, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5-6 мин, удаляют надосадочную жидкость. Осторожно отсасывают тонкий серебристый слой лейкоцитов, готовят мазки, сушат, фиксируют, красят краской Романовского-Гимза. Препараты сушат и микроскопируют.

Подсчет поглощенных микробов ведут в 200 нейтрофилах (50 моноцитов). Интенсивность реакции оценивают по следующим показателям:

1. Фагоцитарный показатель (фагоцитарная активность) — процент фагоцитов из числа сосчитанных клеток.

2. Фагоцитарное число (фагоцитарный индекс) — среднее число микробов, поглощенное одним активным фагоцитом.

Для определения переваривающей способности лейкоцитов периферической крови готовят смесь взятой крови и суспензии микроорганизма и выдерживают в термостате при 37°С 2 часа. Приготовление мазков аналогично. При микроскопии препарата жизнеспособные микробные клетки увеличены в размерах, переваренные же менее интенсивно окрашены, меньших размеров. Для оценки переваривающей функции используют показатель завершенности фагоцитоза – отношение количества переваренных микробов к общему числу поглощенных микробов, выраженное в процентах.

Для оценки активности фагоцитоза используют также тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест).

Принцип метода основан на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя (нитросинего тетразолия) в нерастворимый диформазан. НСТ-тест интегрально характеризует кислородзависимые антиинфекционные системы фагоцита.

В две пробирки, содержащие по 0,05 мл раствора гепарина, вносят по 0,1 мл крови и после перемешивания в одну из них добавляют 0,05 мл суспензии зимозана, а в другую — 0,05 мл раствора Рингера, затем в обе пробирки вносят по 0,05 мл раствора нитросинего тетразолия и инкубируют в водяной бане при 37°С 30 мин, встряхивая каждые 10 мин. После инкубации содержимое перемешивают, делают мазки, фиксируют, окрашивают красителем для НСТ-теста, нанося на стекла 5-7 капель красителя на 1,5 мин, добавляют такое же количество дистиллированной воды. Выдерживают в течение 30 мин, промывают.

При микроскопии препаратов в каждом случае подсчитывают 100 нейтрофилов (25 моноцитов), среди которых выделяют процент клеток, содержащих отложения диформазана (НСТ-позитивные), далее подсчитывают индекс активизации нейтрофилов (моноцитов) по формуле:

ИАН (ИАМ) =

А.0 + В.1 +С.2 + Д.3 , 100(25)

где А - количество клеток, не содержащих диформазановых отложений или содержащих их в виде пылевидных немногочисленных включений;

В - количество клеток, в которых площадь отложения диформазана, не превышает 1/3 площади ядра; С -количество клеток, в которых названные отложения занимают oт 1/3 до всей величины площади ядра; Д — количество клеток с диформазановыми включениями по площади превосходящими площадь ядра.

Активность фагоцитоза обусловлена не только набором его лизосомальных ферментов и синтезируемых ими веществ, но и состоянием проницаемости лизосомной мембраны. Устойчивость к фагоцитозу определяется поверхностными свойствами микробной клетка, наличием факторов типа лейкотоксинов и антифагинов, инактивацией биоксидантов и пр.(Табл. 9)

Таблица 9.

Интенсивность реакции фагоцитоза для человека (норма, нейтрофилы)