Методы количественного определения белков
Для определения концентрации белков в биологических жидкостях и растворах используются оптические, колориметрические и азотометрические методы.
Оптические методы основаны на оптических свойствах белков. К ним относятся:
· спектрофотометрические методы, оценивающие интенсивность поглощения белками УФ лучей в диапазоне около 200 нм и 260 нм.Степень УФЛ - поглощения пропорциональна концентрации белка;
· рефрактометрические методы основаны на способности растворов белков преломлять свет пропорционально их концентрации;
· нефелометрические методы основаны на способности растворов белков рассеивать свет пропорционально их концентрации;
· поляриметрические методы основаны на способности растворов белков вращать плоскость поляризованного света пропорционально их концентрации.
Колориметрические методы основаны на цветных реакциях белков – биуретовая реакция, метод Лоури, метод сорбции белками определённых красителей. Интенсивность окраски определяется концентрацией белкового раствора.
Азотометрические методы основаны на определении содержания азота и пересчёте его на концентрацию белка (в белках 16% азота).
Выделение, фракционирование и очистка белков
Выделение белков из тканей включает несколько этапов.
1. Гомогенизация (измельчение) ткани для разрушения клеточных и внутриклеточных мембран, препятствующих выделению белков. В процессе гомогенизации нередко добавляются детергенты.
2. Экстрагирование (растворение) белков проводят чаще всего слабыми солевыми растворами.
3. Отделение низкомолекулярных веществ (солей) методом диализа с использованием полупроницаемых мембран, методом гель - фильтрации.
4. Очистка белка от сопутствующих белков (фракционирование), основанная на различных физико-химических свойствах белков.
а) ультрацентрифугирование – разделение белков по молекулярной массе;
б) электрофорез – разделение белков по заряду молекулы и молекулярной массе;
в) фракционное высаливание – подбор концентрации соли для осаждения различных белков;
г) хроматографические методы разделения:
· распределительная хроматография – по различной растворимости белков;
· гель-фильтрация – по различной молекулярной массе белков
· ионообменная хроматография – по разнице зарядов белковых молекул
· аффинная хроматография – по химическим свойствам различных белков
5. Выделение белка в кристаллическом состоянии проводится путём лиофилизации (высушивания) при низкой температуре.
Дата добавления: 2016-09-26; просмотров: 2237;