Подготовка и стерилизация лабораторного оборудования

Перед стерилизацией лабораторную посуду моют и сушат. Пробирки, флаконы, бутыли, матрацы и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажные колпачки.

Резиновые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют в отдельном пакете, привязанном к горлышку посуды. Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1—10 штук. Пастеровские пипетки по 3—15 шт. заворачивают в оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты, предупреждающий попадание материала в окружающую среду. При завертывании пипеток нужно соблюдать большую осторожность, чтобы не обломать запаянные концы капилляров. Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец.

В верхнюю часть градуированных пипеток, как и в пастеровские пипетки, вставляют предохранительную вату и затем заворачивают в плотную бумагу, нарезанную предварительно полосками шириной 2—2,5 см и длиной 50—70 см. Полоску кладут на стол, левый конец ее загибают и завертывают им кончик пипетки, затем, вращая пипетку, навертывают на нее ленту бумаги. Для того чтобы бумага не разворачивалась, противоположный конец ее закручивают или приклеивают. На бумаге надписывают объем завернутой пипетки. При наличии пеналов градуированные пипетки стерили­зуют в них.

Лабораторную посуду стерилизуют:

а) сухим жаром при температуре 180°С и 160°С соответственно 1 ч и 150 минут.

б) в автоклаве при давлении 1,5 атм. в течение 60 минут, для уничтожения споровой микрофлоры – 90 минут при 2 атм.

Стерилизация шприцев. Шприцы стерилизуют в разобран­ном виде: отдельно цилиндр и поршень в 2% растворе гидрокарбоната натрия 30 минут. При работе со спороносной микро­флорой стерилизацию производят в автоклаве при 132±2°С (2 атм.) в течение 20 мин, при 126±2°С (1,5 атм.) — 30 мин. Простерилизованный шприц собирают после того, как он остынет, в цилиндр вставляют поршень, надевают иглу, пред­варительно вынув из нее мандрен. Иглу, цилиндр и поршень берут пинцетом, который стерилизуют вместе со шприцем.

Стерилизация металлических инструментов. Металличе­ские инструменты (ножницы, скальпели, пинцеты и пр.) сте­рилизуют в 2% растворе гидрокарбоната натрия, который предупреждает появление ржавчины и потерю остроты. Лез­вия скальпелей и ножниц перед погружением в раствор рекомен­дуется обертывать ватой.

Стерилизация бактериальных петель. Бактериальные пет­ли, сделанные из платиновой или нихромовой проволоки, сте­рилизуют в пламени спиртовой или газовой горелки. Такой способ стерилизации получил название прокаливания или фламбирования.

Петлю в горизонтальном положении вносят в нижнюю, наиболее холодную, часть пламени горелки, чтобы не про­изошло разбрызгивания сжигаемого патогенного материала. После того как он сгорит, петлю переводят в вертикальное положение, накаливают докрасна вначале нижнюю, затем верхнюю часть проволоки и прожигают петледержатель. Про­каливание в целом занимает 5—7 с.

Подготовка к стерилизации и стерилизация бумаги, марли и ваты. Вату, марлю, фильтровальную бумагу стерилизуют в сухожаровой печи при температуре 160°С в течение часа от момента показания термометром данной температуры или в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 30 минут.

Перед стерилизацией бумагу и марлю нарезают кусочка­ми, а вату сворачивают в виде шариков или тампонов нуж­ной величины. После этого каждый вид материала в отдель­ности по одной или несколько штук заворачивают в плотную бумагу. При разрыве пакета стерилизованный материал следует стерилизовать повторно, так как стерильность его нарушается.

Стерилизация перчаток и других резиновых изделий. Из­делия из резины (перчатки, трубки и т. д.), загрязненные ве­гетативной формой микробов, стерилизуют кипячением в 2% растворе гидрокарбоната натрия или текучим паром в те­чение 30 минут; при загрязнении спороносной микрофло­рой—в автоклаве при давлении 1,5—2 атм. в течение 30 или 20 минут. Резиновые перчатки перед стерилизацией внутри и сна­ружи пересыпают тальком для предохранения их от склеива­ния. Между перчатками прокладывают марлю. Каждую пару перчаток завертывают отдельно в марлю и в таком виде по­мещают в биксы.

Стерилизация патогенных культур микробов. Пробирки и чашки, содержащие культуры микробов, не нужные для даль­нейшей работы, складывают в металлический бак, пломбиру­ют крышку и сдают на стерилизацию. Культуры патогенных микробов, вегетативные формы, убивают в автоклаве в течение 30 минут при давле­нии 1 атм. Сдача баков для стерилизации в автоклавную производит­ся специально выделенным лицом под расписку. Режим сте­рилизации регистрируется в специальном журнале. При уничтожении культур микробов I и II групп патогенности, а также материала, зараженного или подозрительного на заражен­ность возбудителями, отнесенными к этим группам, баки с от­работанным материалом переносят на металлических под­носах с высокими бортами в присутствии сопровождающего лица, допущенного к работе с заразным материалом.

Виды стерилизации

Стерилизация кипячением. Стерилизацию кипячением про­изводят в стерилизаторе. В стерилизатор наливают дистиллированную воду, так как водопроводная образует накипь. (Стеклянные предметы погружают в холодную, металлические предметы—в горячую воду с добавлением гидрокарбоната натрия). Стерилизуемые предметы кипятят на слабом огне 30-60 минут. Началом стерилизации считается момент закипания воды в стерилизаторе. По окончании кипячения инструменты берут стерильным пинцетом, который кипятят вместе с остальными предметами.

Стерилизация сухим жаром. Стерилизация сухим жаром производится в печи Пастера. Подготовленный к стерилиза­ции материал кладут на полки так, чтобы он не соприкасался со стенками. Шкаф закрывают и после этого включают обо­грев. Продолжительность стерилизации при температуре 150°С 2 ч, при 165°С – 1 ч, при 180°С – 40 мин, при 200°С – 10-15 мин (при 170°С бумага и вата желтеют, а при более высокой температуре обугливаются). Началом стерилизации считается тот момент, когда тем­пература в печи достигнет нужной высоты. По окончании срока стерилизации печь выключают, но дверцы шкафа не открывают до полного охлаждения, так как холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование тре­щин на горячей посуде.

Стерилизация паром под давлением. Стерилизацию паром под давлением производят в автоклаве. Автоклав состоит из двух котлов, вставленных один в другой, кожуха и крышки. Наружный котел называют водопаровой камерой, внутрен­ний — стерилизационной камерой. В водопаровом котле про­исходит образование пара. Во внутренний котел помещают стерилизуемый материал. В верхней части стерилизационного котла имеются небольшие отверстия, через которые прохо­дит пар из водопаровой камеры. Крышка автоклава гермети­чески привинчивается к кожуху. Кроме перечисленных основных частей, автоклав имеет ряд деталей, регулирующих его работу: манометр, водомер­ное стекло, предохранительный клапан, выпускной, воздушный и конденсационный краны. Манометр служит для опре­деления давления, создающегося в стерилизационной камере. Нор­мальное атмосферное давление (760 мм рт. ст.) принимается за нуль, поэтому в неработающем автоклаве стрелка манометра стоит на нуле. Между показания­ми манометра и температурой имеется определенная зависи­мость (табл. ).

Таблица

Соотношения показаний манометра и температуры кипения воды

Красная черта на шкале ма­нометра определяет максималь­ное рабочее давление, которое допускается в автоклаве. Пре­дохранительный клапан служит для предохранения от чрезмерно­го повышения давления. Его уста­навливают на заданное давление, то есть, давление, при котором нуж­но производить стерилизацию, при переходе стрелки манометра за черту клапан автоклава автоматически открывается и выпускает лишний пар, замедляя тем самым дальнейший подъем давления.

На боковой стенке автоклава имеется водомерное стекло, показывающее уровень воды в водопаровом котле. На трубке водомерного стекла нанесены две горизонтальные черты — нижняя и верхняя, обозначающие соответственно допускаемый нижний и верхний уровень воды в водопаровой ка­мере. Воздушный кран предназначен для удаления воздуха из стерилизационной и водопаровой камер в начале стерилиза­ции, так как воздух, являясь плохим проводником тепла, на­рушает режим стерилизации. На дне автоклава находится конденсационный кран для освобождения стерилизационной камеры от конденсата, образующегося в период нагревания стерилизуемого материала.

Правила работы с автоклавом. Перед началом работы осматривают автоклав и контрольно-измеритель­ную аппаратуру. В автоклавах с автоматическим регулированием пара на электровакуумном манометре водопаровой камеры стрелки устанавливают в соответствии с режимом стерилизации: ниж­нюю стрелку ставят на 0,1 атм. ниже, верхнюю—на 0,1 атм. выше рабочего давления, водопаровую камеру заполняют водой до верхней отметки мерного стекла. В период заполнения водой вентиль на трубе, по которой пар поступает в камеру, держат открытым для свободного выхода воздуха из котла. Стерилизационную камеру автоклава загружают стерилизуемым материалом. После этого крышку (или дверцу) автоклава закрывают, плотно закрепляя центральным затвором или болтами; чтобы избежать перекоса, болты завинчивают крест-накрест (по диаметру). Затем включают источник подогрева (электрический ток, пар), закрывая вентиль на тру­бе, соединяющей источник пара со стерилизационной камерой. С началом парообразования и создания давления в водопаровой камере производят продувку (удаление воздуха из стерилизационного котла). Способ удаления воздуха определяется конструкцией автоклава. Вначале воздух выходит отдельными порциями, затем появляется ровная непрерывная струя пара, указывающая, что из стерилизационной камеры воздух полностью вытеснен. После удаления воздуха кран закрывают, и в стерилизационной камере начинается постепенное повышение давления.

Началом стерилизации считается тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. После этого интенсивность подогрева уменьшают, чтобы давление в автоклаве в течение нужного времени оставалось на одном уровне. По окончании времени стерилизации подогревание прекращают. Закрывают вентиль в трубопроводе, подающем пар в стерилизационную камеру, и открывают вентиль на конденсационной (нисходящей) трубе для снижения давления пара в камере. После падения стрелки манометра до нуля медлен­но ослабляют прижимные приспособления и открывают крыш­ку автоклава.

Температура и продолжительность стерилизации опреде­ляются качеством стерилизуемого материала и свойствами тех микроорганизмов, которыми он заражен.

Контроль температуры в стерилизационной камере осуще­ствляется периодически с помощью бактериологических тестов. Биотесты изготовляются бактериологическими лабораториями ЦСЭН. В случае непрохождения данных тестов производят проверку технического состояния автоклава.

Стерилизация текучим паром.Стерилизация текучим паром производится в текучепаровом аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Аппарат Коха представляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном. Пространство между верхней и нижней пластинками дна заполняют на 2/3 водой (для спуска оставшейся после стерилизации воды есть кран). Крышка аппарата имеет в центре отверстие для термометра и несколь­ко небольших отверстий для выхода пара. Стерилизуемый материал загружают в камеру аппарата неплотно, чтобы обеспечить возможность наибольшего кон­такта его с паром. Началом стерилизации считается время с момента закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру. В текучепаровом аппарате стерилизуют, главным образом, питательные среды, свойства которых из­меняются при температуре выше 100°С. Стерилизацию текучим паром следует проводить повтор­но, так как однократное прогревание при температуре 100°С не обеспечивает полного обеззараживания. Такой метод полу­чил название дробной стерилизации: обработку сте­рилизуемого материала текучим паром проводят по 30 минут ежедневно в течение 3 дней. В промежутках между стери­лизациями материал выдерживают при комнатной темпера­туре для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях.

Тиндализация. Тиндализация—дробная стерилизация с применением температуры ниже 100°С, предложенная Тиндалем. Прогревание стерилизуемoгo материала производят в водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу при температуре 60—65°С в течение 5 дней или при 70— 80°C в течение 3 дней. В промежутках между прогреваниями обрабатывае­мый материал выдерживают при температуре 25°С для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогрева­ниях. Тиндализацией пользуются для обеспложивания питательных сред, содержащих белок.

Механическая стерилизация с помощью бактериальных ультрафильтров. Бактериальные фильтры применяют для освобождения жидкости от находящихся в ней бактерий, а также для отделения бактерий от вирусов, фагов и экзоток­синов. Вирусы бактериальными фильтрами не задерживаются, и поэтому ультрафильтрацию нельзя рассматривать как сте­рилизацию в принятом значении этого слова. Для изготовления ультрафильтров применяют мелкопористые материалы (каолин, асбест, нитроцеллюлоза и др.), спо­собные задерживать бактерии.

Асбестовые фильтры (фильтры Зейтца) представляют собой асбестовые пластинки толщиной 3—5 мм и диаметром 35 и 140 мм для фильтрации малых и больших объемов жидкости. В нашей стране асбестовые фильтры, изготовляют двух марок: «Ф» (фильтрующие), за­держивающие взвешенные частицы, но пропускающие бакте­рии, и «СФ» (стерилизующие), более плотные, задерживаю­щие бактерии. Перед употреблением асбестовые фильтры монтируют в фильтровальные аппараты и вместе с ними стерилизуют в ав­токлаве. Асбестовые фильтры используются однократно. Мембранные ультрафильтры изготавливаются из нитроцеллюлозы и представляют собой диски белого цвета диаметром 35 мм и толщиной 0,1 мм.

Бактериальные фильтры разли­чаются по величине пор и обозна­чаются порядковыми номерами (табл. ).

Таблица

Бактериальные фильтры

Непосредственно перед употреб­лением мембранные фильтры сте­рилизуют кипячением. Фильтры по­мещают в дистиллированную воду, подогретую до температуры 50— 60°С, чтобы предупредить их скру­чивание, кипятят на слабом огне в течение 30 минут, меняя 2—3 раза воду. Простерилизованные фильтры во избежание их повреждения вы­нимают из стерилизатора фламбированным и остуженным пинцетом с гладкими кончиками.

Для фильтрации жидкостей бактериальные фильтры монтируют в специальные фильтро­вальные приборы, в частности, в фильтр Зейтца.

Он состоит из 2-х частей: верхней, имеющей форму цилиндра или воронки, и нижней—опорной части аппарата, с так называемым фильтровальным столиком из металлической сетки или чистой керамической пластинки, на которую помещают мембранный или асбестовый фильтр. Опорная часть аппарата имеет форму воронки, суживающаяся часть которой находится в резиновой пробке горлышка колбы Бунзена. В рабочем состоянии верхнюю часть прибора фиксируют на нижней с помощью винтов. Перед началом фильтрации места соединения различных частей установки для создания герметичности заливают парафином. Отводную трубку колбы присоединяют толстостенной ре­зиновой трубкой к водоструйному, масляному или велосипедному нacocy. После этого в цилиндр или воронку аппарата наливают фильтруемую жидкость и включают насос, создающий вакуум в приемном сосуде. В результате образующейся разности давлений фильтруемая жидкость проходит через поры фильтра в приемник. Микроорганизмы остаются на поверхности фильтра.