Приготовление препаратов для микроскопии живых микроорганизмов
Для исследования живых бактериальных клеток разработан ряд методов. При микроскопии можно использовать культуры, выращенные в жидких средах, однако для получения нужного числа бактерий они нуждаются, как правило, в разведении стерильной средой. Культуры, выращенные на твердых средах, можно суспендировать (развести) с помощью стерильной петли или иглы в капле стерильной жидкой среды или какого-нибудь раствора, но не водопроводной воды, до слабого помутнения. Следует помнить, что возраст культуры и физико-химические параметры среды могут быть причиной ненаследуемых (фенотипических) модификаций как внепротоплазматических компонентов (жгутики и капсулы), так и компонентов, находящихся внутри собственно клетки (различные включения); все эти компоненты являются важными признаками, по которым ведется идентификация. Вместе с тем специальные операции или пересевы, производимые в лаборатории, могут благоприятствовать развитию мутантов, имеющих наследственно измененные по сравнению с диким типом черты строения. Изменения могут быть стабильными и нестабильными, но очевидно, что при описании формы и структуры бактерий условия содержания культуры должны быть строго определенными, так как старение культуры и изменения состава среды могут быть причиной ряда морфологических изменений.
Ниже мы приводим методы, которые часто используются при исследовании живых клеток в целях идентификации.
Для приготовления влажных препаратов одну каплю пробы (около 0,05—0,1 мл) помещают на чистую обезжиренную поверхность предметного стекла (толщиной 0,8—1,0 мм), затем накрывают ее покровным стеклом. Последнее имеет форму квадрата со стороной 22 мм, толщина его составляет от 0,13 до 0,16 мм (номер 1 или 11/2). Чтобы предотвратить конвекционные токи, смещение или высыхание, зазор между покровным и предметным стеклами герметично заливают васпаром (смесь равных объемов петролатума и парафинового воска), петролатумом, свечным воском (используя фитиль свечи в качестве кисточки для нанесения расплавленного воска) или прозрачным лаком для ногтей.
В течение короткого промежутка времени в этих препаратах можно наблюдать подвижность облигатных аэробных бактерий, однако, как только кислород истощится, бактерии прекращают движение.
Для рассматривания влажных препаратов рекомендуется фазово-контрастная микроскопия, причем для получения наилучших результатов следует использовать как можно более тонкую водную пленку. Кусочек промокательной бумаги, положенный поверх покровного стекла для герметизации, способствует выводу излишнего количества жидкости (так что в препарате остается лишь необходимая для просмотра тонкая пленка) и подсушиванию поверхности потенциальных полей зрения. Тепло от источника света может нарушить оптимальные движения бактерий. Если наблюдения ведутся в течение длительного периода времени, рекомендуется вставлять тепловой фильтр. Поскольку белый свет может вызывать нарушение подвижности, применяют зеленый светофильтр, лучше других реализующий коррекции, даваемые линзами, и хорошо воспринимаемый глазом наблюдателя. Нагревание пробы предотвращают также с помощью задерживающей оптической вставки, заполненной 5-сантиметровым слоем раствора Мора (50 г сульфата железа и аммония, 1,3 мл 33%-ной (объем/объем) серной кислоты и 250 мл дистиллированной воды).
Поступательное перемещение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев иммерсионный масляный объектив. Скорость перемещения бактерий варьирует, и медленно движущиеся организмы следует отличать от тех, которым свойственно лишь броуновское движение. Описаны некоторые неподвижные мутанты, обладающие жгутиками. Чтобы убедиться в том, что жгутики действительно присущи данной бактерии, а также чтобы определить их расположение (полярное, перитрихальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания.
Если используется обычный конденсор и масляно-иммерсионный объектив, для улучшения контраста количество света нужно уменьшить апертурной диафрагмой, а конденсор опустить. Наиболее эффективный (и наиболее демонстративный) способ наблюдения за подвижными микроорганизмами при малом увеличении—это темнопольная микроскопия. Необходимые для нее специальные конденсоры доступны далеко не всем, однако вполне удовлетворительное темное поле можно получить, применив для освещения иммерсионный конденсор от фазово-контрастного микроскопа и расположенную на нужном месте фазовую пластинку; наблюдения при этом ведут с помощью обычных (не фазово-контрастных) объективов с увеличением 10´ или 45´. Иммерсионная жидкость на конденсор не наносится, а положение конденсора, для которого характерно самое хорошее темное поле, находится экспериментальным путем. С помощью этого ухищрения оказывается возможным увидеть под малым увеличением даже спирохеты.
Некоторым бактериям присущ особый тип поступательного движения при контакте с твердой поверхностью, известный как «скольжение». Это относительно медленное, моментами прекращающееся, а затем возобновляющееся продвижение в направлении, параллельном продольной оси организма. Для скольжения характерна частая смена направлений движения и отсутствие наружных локомоторных органелл. Такого типа подвижность можно предположить, если при микроскопическом обследовании (с безиммерсионными объективами большого увеличения) краев колоний обнаруживают отделенные от самого края одиночные клетки или группы клеток. Часто в первичной среде выделения скольжение не выявляется; обычно его легче обнаружить на твердых средах с небольшим количеством питательных веществ, соответствующих их содержанию в естественной для данной группы среде обитания.
Скольжение следует отличать от роения, которое выражается в движении за счет жгутиков в особых условиях. Роение—это распространение микроорганизмов по относительно сухой поверхности, например, агара, где они движутся в виде больших протяженных островков или микроколоний. У наблюдаемых при этом скоплений постоянно меняются очертания — от коротких языковидных выступов и изолированных групп до переплетающихся полос, чередующихся с пустотами. В местах этих пустот видны следы движения, часто рассматриваемые в качестве признака скольжения и хорошо сохраняющиеся фиксацией по Боуэну in situ. Молодые активные культуры нитевидных организмов, передвигающихся скольжением, оставляют волнообразные, завитые или спиралевидные рисунки. Поступательное перемещение путем скольжения происходит со скоростью 10—15 мкм/с.
Раздавленная капля. На предметное стекло наносят каплю бульонной культуры. При обильном росте микробов культуру предварительно разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Нанесенную на предметное стекло каплю раздавливают. Для этого покровное стекло ставят на ребро у края капли и, опуская, постепенно вытесняют воздух, находящийся между предметным и покровным стеклами, чтобы избежать образования пузырьков. В правильно приготовленном препарате раздавленной капли стекла плотно склеиваются и жидкость тончайшим слоем заполняет пространство между ними, не выступая за края покровного стекла.
Висячая капля. На середину необезжиренного покровного стекла наносят небольшую, с четкими краями каплю бульонной культуры. Каплю материала покрывают предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло с прилипшим к нему покровным стеклом перевертывают. Капля оказывается висячей в герметически закрытой влажной камере, из которой жидкость испаряется очень медленно, и поэтому препарат долгое время остается пригодным для наблюдения. Висячую каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой. При малом увеличении (8´) находят край капли, отчетливо видный в затемненном поле зрения. По одну сторону линии (края) видно множество мельчайших капелек конденсата, осевших на внутренней поверхности покровного стекла, по другую сторону линии фон равномерно серого цвета — искомая капля. Найденный край капли устанавливают в центре поля зрения микроскопа при малом увеличении и, не сдвигая препарата, переходят на более сильную (40´ или иммерсионную) систему, слегка расширив диафрагму микроскопа.
Живые микробы, находящиеся в препарате раздавленной капли, можно изучать и в темном поле зрения. При этом методе микроскопии толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм, покровных—0,2 мм. Принцип исследования микробов в темном поле зрения заключается в том, что в объектив и, следовательно, в глаз наблюдателя попадают не прямые лучи света, а отраженные исследуемым объектом. Вследствие этого неосвещенное поле зрения остается совершенно темным, а микробные тела, отражающие лучи света, освещены очень ярко.
Для создания темного поля конденсор Аббе заменяют темнопольным конденсором, имеющим затемнение центральной части. При отсутствии специального берут обычный конденсор Аббе, развинчивают и вкладывают между его линзами кружок черной фотобумаги так, чтобы незначительная периферическая часть линзы оставалась свободной.
При микроскопии препаратов в темном поле зрения на верхнюю поверхность конденсора наносят каплю кедрового или вазелинового масла, поверх которой очень осторожно, чтобы не образовалось пузырьков воздуха, накладывают препарат. На покровное стекло наносится вторая капля масла. Наносить масло на обе поверхности препарата необходимо для того, чтобы при микроскопии с иммерсионной системой проходящие лучи света не преломлялись.
Метод висячего агарового слоя. Для приготовления препаратов живых клеток типа «висячая капля» существует хорошее приспособление — пластина из прозрачной пластмассы с высверленным в центре отверстием, имеющим диаметр около 1 см. Покровное стекло с висящей на нем каплей помещают над отверстием, а для того, чтобы стекло удерживалось на месте, на его край наносят каплю иммерсионного масла или воды. Подобным образом к стеклу можно прикрепить тонкий слой агара с растущей культурой или островками колоний, размазанных по стерильной находящейся рядом с ними поверхности. Образуемую отверстием камеру можно закрыть, прикрепив снизу покровное стекло.
Негативное окрашивание. Этот вид окрашивания дает возможность самыми простыми, а зачастую и самыми быстрыми способами получить информацию о преломляющих свет включениях, таких, как сера или гранулы поли-(р)-оксимасляной кислоты, и о спорах. При его осуществлении взятый петлей 7%-ный (вес/объем) водный нигрозин (или тушь, или конго красный) тщательно перемешивают с бактериальной суспензией на покровном стекле, размазывают смесь до образования тонкой пленки и высушивают на воздухе. Затем кладут покровное стекло на предметное пленкой вниз и фиксируют его положение одной-двумя каплями свечного воска. В приготовленных подобным образом препаратах, содержащих вместо заливки воздушный слой, бактерии не прокрашиваются и выделяются на темно-синем фоне ярким свечением. В дальнейшем они даже могут быть использованы в работах по изучению характера и степени разрушения клеток. Негативно окрашенные препараты не следует применять для измерения длины и ширины клеток, так как вокруг клеточной стенки может находиться капсула или слой слизи. Более того, отрицательно заряженные частицы коллоидного нигрозина не реагируют с клеточной поверхностью, поскольку при физиологических значениях рН последняя также заряжена отрицательно. При высыхании коллоидной пленки благодаря одинаковому заряду коллоидных частиц и бактерий черный край высыхающей пленки находится на относительно значительном, хотя и маленьком абсолютно расстоянии от истинной границы клетки. В результате видимый размер бактерии оказывается больше, чем действительный, даже если нет капсулы.
В растворах нигрозина могут появиться посторонние микроорганизмы; предотвратить это помогает небольшая добавка формальдегида, не ухудшающая свойств раствора.
Дата добавления: 2020-11-18; просмотров: 420;