Приготовление мазков
Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают.
Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла.
Мазки готовят из культур микробов, патологического материала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов.
Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала.
Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной средой и из жидкого патологического материала (моча, ликвор и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериальной петлей на предметное стекло и круговыми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету.
Приготовление мазков из крови. На предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови. Второе — шлифованное — стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и одинаковую толщину на всем протяжении.
Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к выступающей капле крови. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине копеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до высыхания крови. Кровь в «толстой капле» распределяется неравномерно, образуя неровный край.
Приготовление мазка из вязкого материала (мокрота, гной). Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг другу.
После этого свободные концы стекол захватывают 1 и 2 пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределенным материалом, занимающим большую площадь.
Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного предметного стекла наносят каплю воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры, так, чтобы капля жидкости стала слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени и приступают к приготовлению мазка по вышеописанному способу.
Приготовление мазков из органов и тканей.Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабливании материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериальной петлей.
Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпечатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают последовательно несколько раз поверхностью среза к предметному стеклу, получая, таким образом, ряд мазков-отпечатков.
Высушивание и фиксация мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.
Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение средств, вызывающих коагуляцию белков. Нельзя фиксировать над пламенем мазки, содержащие возбудителей I – II групп патогенности.
Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.
Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения, приведенные в таблице 4.
Таблица
Вещества для химической фиксации
Фиксирующее вещество | Время фиксации, мин |
Безводный метиловый спирт | |
Этиловый спирт 96% | 10—15 |
Жидкость Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в соотношении 1:1) | 10—15 |
Жидкость Карнуа (этанола 96% 60 мл, хлороформа 30 мл, уксусной кислоты ледяной 10 мл) | 10-15 |
H2O2 3% в 96% спирте (для фиксации споровых микроорганизмов) |
Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе.
Окраска мазков
Техника окраски мазков. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, что предложено А.И. Синевым. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящей бумаги в течение неограниченно долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски.
Окраска мазков красящей бумагой. На высушенный и фиксированный препарат наносят несколько капель воды, кладут окрашенные бумажки величиной 2´2 см. В течение всего времени окрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла. При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется методом окраски. По окончании окраски бумагу осторожно снимают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой.
Окраска мазков растворами красителей. На высушенный и фиксированный препарат пипеткой наносят краситель в таком количестве, чтобы он покрывал весь мазок. При окраске мазков концентрированными растворами красителей (карболовый фуксин Циля, карболовый генциановый или кристаллический фиолетовый) окрашивание производят через фильтровальную бумагу, задерживающую частицы красителя: на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор красителя.
Для микроскопического исследования приготовленные мазки, высушенные и зафиксированные, подвергают окраске. Окраска бывает простая и сложная. Простая окраска заключается в нанесении на мазок какой-либо одной краски на определенный промежуток времени. Чаще всего для простой окраски применяют спирто-водный (1:10) фуксин Пфейффера, леффлеровскую метиленовую синьку и сафранин. Эозин, как кислая краска, употребляется только для окраски цитоплазмы клеток и подкраски фона. Кислый фуксин совершенно непригоден для окраски бактерий.
При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из чистой культуры) окрашиваются в тот же цвет, но несколько бледнее. Фуксин и генцианвиолет относятся к более интенсивно окрашивающим краскам; метиленовая синька окрашивает значительно бледнее. Восприятие окраски зависит не только от свойств красок, но и от свойств подвергаемых окраске микробов. Большинство микробов легко и быстро окрашивается водными или спирто-водными растворами красок.
Для трудно воспринимающих окраску микробов (например, возбудитель туберкулеза) или их частей (споры, жгутики и пр.) приходится применять более интенсивные (форсированные) методы окраски.
Форсировать окраску можно: а) повышением красящей способности основных красок, б) удлинением срока окраски и в) действием протрав.
Для повышения красящей способности воздействуют на краску высокой температурой (нагреванием) до появления паров (вплоть до кипения). Варьируя степень нагревания, можно получать различные степени силы окраски.
Удлинение срока воздействия красящего раствора на объект также может в известной мере усилить степень окраски.
Протравами являются вещества, облегчающие проникновение краски внутрь клеток: фенол, танин, уксусная и хромовая кислоты, щелочи и др. Механизм действия протрав различен: в одних случаях протравы действуют на краски, в других—на способность клеток к восприятию окраски. Протравами воздействуют на мазок или перед действием краски (например, при окраске жгутиков), или совместно с краской (фенол в фуксине Циля), или же после действия краски (люголевский раствор в методе Грама).
При окраске мазков, кроме красок, применяются еще так называемые обесцвечивающие или раскрашивающие вещества. Последние служат для удаления излишка краски из всей микробной клетки или же из ее части при слишком энергичной адсорбции краски материалом или при перекрашивании его с применением нагревания и т. п.
В качестве обесцвечивающих веществ применяются: спирт, 5% водный раствор серной кислоты, 20—30% водный раствор азотной кислоты, 3% раствор соляной кислоты в абсолютном алкоголе и др.
Для окраски мазков необходимо иметь на рабочем столе набор красящих растворов во флаконах (лучше оранжевого стекла) с пипетками и резиновыми баллончиками. Флаконы должны быть снабжены этикетками с соответствующими обозначениями; во избежание быстрого загрязнения красками этикетки рекомендуется пропитывать расплавленным парафином (при помощи кисточки). Флаконы с красками помещают в деревянный штатив - колодку (рис. 2).
Рис. 2.Флаконы для красок
Для смывания красок и ополаскивания мазков необходимы бутыль с тубусом на подставке для дистиллированной воды и кристаллизатор (сливная чашка) с подставкой-мостиком для мазков. Подставка-мостик представляет собой две стеклянные трубки или палочки, соединенные на концах отрезками резиновых трубок. Ширина подставки должна быть меньше длины предметного стекла. Кроме того, для окраски мазков необходимы спиртовая (или газовая) горелка и пинцет Корнэ для предметных стекол. При окраске с подогреванием предметное стекло захватывают пинцетом и выдерживают определенное время над пламенем. При продолжительной окраске употребляют кюветки или небольшие стаканчики, куда наливают краску и погружают в нее мазок. При одновременной окраске в кюветке нескольких мазков, для того, чтобы стекла не слипались, их соединяют по два намазанной стороной наружу и укрепляют резиновыми кольцами, нарезанными из трубок. После окраски мазки промывают водой и тщательно высушивают фильтровальной бумагой.
Работами последних лет выявлена возможность сохранения при окраске жизнеспособности микробов, главным образом, спороносных. Поэтому необходима достаточная фиксация мазков. Промывные воды (при окрасках) нужно сливать в специальный сосуд с последующим обезвреживанием, отработанную фильтровальную бумагу (после просушки мазков) не выбрасывать, а сжигать, использованные мазки дезинфицировать.
Дата добавления: 2020-11-18; просмотров: 581;