Понятия обратимых и необратимых процессов 6 глава

Таким образом, основная идея рентгеноструктурного анализа состоит в определении расстояния d на основании дифракционной картины, получаемой для лучей с известной длиной волны. Известно, что кристаллическая решетка кристаллов характеризуется набором кристаллических плоскостей. Эти плоскости можно охарактеризовать целыми числами, называемыми миллеровскими индексами. Соответственно на рентгенограмме наблюдается множество дифракционных тел. Их число особенно велико для кристаллов белка, что связано с относительно большими периодами кристаллической решетки. Дифракционная щель обладает различными интенсивностями. Их анализ позволяет найти распределения электронной плотности в кристалле. Эта плотность выражается через структурные амплитуды, которые зависят от числа электронов в атоме. Структурные амплитуды — величины комплексные, которые характеризуются модулями и фазами. Не зная фаз, нельзя установить структуру объекта. Метод определения фаз состоит в том, что к молекулам, образующим кристалл, присоединяют тяжелые атомы, например атомы ртути. Тяжелый атом, имеющий много электронов и сильно рассеивающий рентгеновские лучи (РЛ), вызывает заметные изменения интенсивности дифракционных пятен. По разности амплитуд можно определить фазу. При введении тяжелых атомов наблюдается полное сохранение структуры белкового кристалла. Найденная интенсивность распределения электронной плотности r(x, y, z) изображается в виде геодезических карт, на которых линии соединяют точки с одинаковыми значениями r. Пространственное распределение плотности делают видимым путем наложения друг на друга контурных карт, которые вычерчиваются на листах прозрачного пластика. В 1944 году М. Ходжкину удалось расшифровать с помощью контурных карт структуру пенициллина. Молекула пенициллина содержит 23 атома. В дальнейшем была расшифрована структура витамина B₁₂ (93 атома). После этого рентгеноструктурный анализ стали применять для расшифровки наиболее сложных атомов. Основоположниками данного направления являются ученые Кембриджской научной школы (У.Л. Брегг, М.Ф. Перуц). В 1957 году Дж.К. Кендрю установил пространственное строение белка – гемоглобина, определив положение 2500 его атомов. В настоящее время для точного определения фазы изменяют несколько раз интенсивность РЛ при их дифракции, как от чистого белка, так и от его производных, содержащих тяжелые атомы. В расчетах фигурируют десятки миллионов чисел. Поэтому для получения рентгенограммы используют ЭВМ.

С помощью рентгеноструктурного анализа было показано, что для ряда биополимеров, в частности для ДНК, характерно спиральное строение. В этом случае на рентгенограмме наблюдается преимущественное расположение дифракционных пятен вдоль прямых. Таким способом была установлена знаменитая двойная спираль ДНК. Для ряда белков и некоторых других волокнистых веществ характерны нарушения упорядоченности с сохранением параллельности осей молекул. Синтетические аморфные полимеры, например каучук, дают, подобно жидкостям, дифракционные картины в виде совокупности концентрических колец (диаграмма Дебая-Шедера).

При изучении строения мембран с помощью рентгеноструктурного анализа было подтверждено упорядоченное расположение липидных молекул. Липиды находятся, при физиологических условиях, в жидком агрегатном состоянии. Это позволило сравнить мембрану с фосфолипидным морем, по которому плавают белковые «айсберги». Была подтверждена толщина мембраны (≈ 8 нм).

Рентгеноструктурный анализ показал, что кроме фосфолипидов и белков в биологических мембранах содержатся и другие химические соединения - холестерин, гликолипиды и т.д.

4.5.3. Поляриметрия

Электромагнитная волна, в которой вектор E лежит в одной определенной плоскости, называется плоскополяризованной.

Плоскость, проходящая через электрический вектор E в направлении распространения электромагнитной волны, является плоскостью поляризации.

Плоскополяризованную волну излучает отдельный атом.

В естественном свете, идущем от солнца, накаленной нити лампы, газоразрядной трубки и т.д., складываются неупорядоченные излучения множества хаотически ориентируемых атомов, и поэтому направление вектора E не находится в одной плоскости.

Таким образом, свет можно рассматривать как наложение плоскополяризованных волн с хаотической ориентацией плоскостей колебаний, электрические векторы которых ориентированы по всевозможным перпендикулярным лучу направлениям.

Устройство, позволяющее получить поляризованный свет из естественного, называется поляризатором.

При вращении поляризатора относительно луча естественного света поворачивается плоскость колебаний вышедшего плоско-поляризованного света. Следовательно, поляризатор можно использовать для анализа поляризованного света. В данном случае его называют анализатором.

Если плоскополяризованный свет с амплитудой электрического вектора E₀ падает на анализатор, то он пропустит некоторую составляющую

, (4.13)

где φ – угол между главными плоскостями поляризатора и анализатора.

Так как интенсивность света пропорциональна квадрату амплитуды колебаний, то

, (4.14)

где J₀ – интенсивность поляризованного света, падающего на анализатор;

J – интенсивность света, выходящего из анализатора.

Уравнение (4.14) является законом Малюса.

Плоскополяризованный луч можно получить при отражении света от границы двух диэлектриков.

По закону Брюггера, если угол падения удовлетворяет условию

, (4.15)

где i – угол полной поляризации;

n – относительный показатель преломления двух сред,

то отраженный луч полностью будет плоскополяризован.

Плоскополяризованный луч можно получить при явлении двойного лучепреломления, которое наблюдается у ряда кристаллов.

Сущность двойного лучепреломления заключается в том, что при попадании света на кристалл луч раздваивается. Для одного из лучей выполняются законы преломления. Поэтому этот луч называют обыкновенным. Для другого луча эти законы не выполняются. Его называют необыкновенным.

Колебания обыкновенного луча перпендикулярны главной плоскости кристалла, а у необыкновенного лежат в главной плоскости. Оба луча поляризованы во взаимно перпендикулярных плоскостях.

Двойное лучепреломление объясняется особенностями распространения электромагнитных волн в анизотропных средах – амплитуды вынужденных колебаний электронов зависят от направлений этих колебаний.

Кристаллы, обладающие свойствами двойного лучепреломления, непосредственно не используются как поляризаторы, так как пучки обыкновенных и необыкновенных лучей слишком слабо разведенны, а в некоторых случаях перекрывают друг друга.

Однако из этих кристаллов изготавливают специальные поляризованные призмы. К таким наиболее распространенным призмам относится призма Николя. Она представляет собой призму, изготовленную из кристалла исландского шпата, который разрезан по диагонали и склеен клеем канадским бальзамом (рис. 4.16), для которого n= 1,550; что соответствует показателю преломления обыкновенного луча. Это позволяет, подобрав соответствующим образом углы призмы, обеспечить полное отражение обыкновенного луча (о) на границе с канадским бальзамом.

Рис. 4.16. Призма Николя

Необыкновенный луч (е) выходит из призмы Николя параллельно нижней грани.

Существуют другого вида поляризаторы – турмалин, а также поляроиды, которые состоят из мелких кристалликов герапатита, выложенных с помощью электрического поля на целлулоидной пленке.

Основными недостатками турмалина и поляроидов, по сравнению с призмой Николя, являются их плохие спектральные характеристики.

Вещества, обладающие свойством вращать плоскость поляризационного луча, называются оптическими.

Если между анализатором и поляризатором поместить кварцевую пластинку так, чтобы свет проходил вдоль ее оптической оси, то свет дойдет до наблюдателя.

Если же анализатор повернуть на некоторый угол, то можно вновь добиться затемнения; используя свет различной длины, можно обнаружить дисперсию вращению плоскости поляризации, то есть зависимость угла поворота плоскости поляризационного луча от длины волны.

Для определенной длины волны угол поворота плоскости поляризации (α) пропорционален расстоянию ( ), пройденному светом в оптически активном веществе.

, или ,

где - коэффициент пропорциональности или постоянная вращения, град/мм.

Для растворов был установлен закон

,

где С – концентрация оптически активного вещества;

- толщина слоя раствора;

[ ] - удельное вращение; ~1/λ² и зависит от температуры и свойств растворителя.

Оптически активные вещества делятся на правовращающиеся, то есть вращение плоскости поляризации происходит по часовой стрелке, и вращающиеся против часовой стрелки, левовращающиеся, вещества.

Постоянная вращения в обоих случаях одинакова. К оптически активным веществам относятся чистые жидкости (скипидар), растворы активных веществ в неактивных растворителях (раствор сахара в воде), некоторые газы и пары (пары камфоры).

Метод измерения концентрации растворенных веществ называется поляриметрией.

Метод измерения сахара в моче, в биофизических исследованиях, а также в пищевой промышленности называется сахарометрией.

Соответствующие измерительные приборы называются поляриметрами и сахариметрами. Поляриметр позволяет измерять не только концентрацию, но и удельное вращение.

Используя светофильтры, можно найти зависимость удельного вращения от длины волны, то есть дисперсию оптической активности. Приборы, используемые для этой цели, называются спектрополяриметрами.

Поляриметрия в молекулярной биофизике используется как метод, позволяющий использовать структурные превращения биологического вещества. В частности, он находит графическую зависимость удельного вращения полипептидов от состава растворителя (дихлоруксусной кислоты). При 80 % дихлоруксусной кислоты происходит резкое падение активности. Это свидетельствует об изменении конформации полипептида.

В биологии и медицине широко используется поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп аналогичен обычному биологическому микроскопу, но имеет поляризатор перед конденсатором и анализатор в тубусе между объективом и окуляром. Предметный столик может вращаться вокруг оптической оси микроскопа.

Таким образом, объект освещают поляризованными лучами и рассматривают через анализатор. Если скрестить поляризатор и анализатор, то поле зрения будет темным. Так как некоторые ткани – мышечная и костная – обладают оптической анизотропией, то при помещении последних на предметный столик будут видны только те волокна мышечной или костной ткани, анизотропия которых изменяет поляризационный свет.

Поляризованный свет может быть использован в модельных условиях для оценки механических напряжений, возникающих в костных тканях. Данный метод основан на явлении фотоупругости, которое заключается в возникновении оптической анизотропии в первоначально изотропных твердых телах под действием механических нагрузок.

Поляризационный микроскоп широко используется для изучения строения клеток.

4.5.4. Электронный парамагнитный резонанс

С помощью электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) было доказано наличие микровязкости в клеточных мембранах, которая играет огромную роль в диагностике некоторых заболеваний.

Остановимся более подробно на данных методах. Метод ЭПР в медико-биологических исследованиях применяется для обнаружения свободных радикалов, например, при облучении белков. Это дает возможность проследить изменения первичных предметов радиационного поражения. Свободные радикалы образуются при перикисном окислении липидов в мембранах клеток, что приводит к патологии, в частности к лучевой болезни. В биологических мембранах липиды находятся преимущественно в жидкокристаллическом состоянии, и жидкокислотные цепи фосфолипидов обладают значительной подвижностью. Изучение биомембран стало возможным благодаря развитию методов ЭПР и ЯМР. Применение этих методов для изучения свойств липидного слоя мембран основано на том, что форма наблюдаемых сигналов зависит от свойств свободного радикала и протонов ядер водорода, а также от микровязкости окружающей среды. Рассмотрим более подробно теорию ЭПР-метода.

Пусть вращается электрон вокруг ядра атома элемента (рис. 4.17).

Рис. 4.17. Модель атома водорода

Неспаренный электрон в атоме, при движении по орбите, обладает собственным орбитальным механическим моментом

,

где m_e – масса электрона, кг;

- линейная скорость, м/с;

r - радиус, м,

и орбитальным магнитным моментом P=JS, где J - величина кругового тока.

где - частота, Гн;

е – заряд электрона, Кл.

. (4.16)

; .

Отношение

P_м/L=e/(2m_е)=G (4.17)

называется магнитомеханическим отношением для орбитального движения электрона. Кроме орбитального момента, электрон обладает собственным моментом количества движения - спином. Связь между собственным моментом электрона (спином) и G выражается соотношением

P_ms/G = gs, (4.18)

где s - собственный момент количества движения;

Р_ms - собственный магнитный момент;

g – ускорение свободного падения, м/с².

Так как , то магнитный момент для спинов

; . (4.19)

Соотношение (4.19) показывает, что между магнитным и механическим моментами импульса существует жесткая связь.

Таким образом,

. (4.20)

При наложении на одноэлектронный атом постоянного магнитного поля (см. рис. 4.19) орбитальный (Р_m) и спиновой (P_ms) магнитные моменты электрона будут взаимодействовать, и энергия взаимодействия будет

Рис.4.19. Атом водорода в однородном магнитном поле

E=PBcosα, (4.21)

где В - индукция магнитного поля, Тл;

Р - векторная сумма орбитального и спинового магнитных моментов электрона;

α - угол между направлениями В и Р,

или

. (4.22)

обозначим , тогда

, (4.23)

где - магнетон Бора - единица измерения магнитных моментов атома.

При наложении внешнего магнитного поля не спаренные электроны разбиваются на две группы:

1) электроны, магнитный момент которых ориентируется в направлении магнитного поля. В данном случае энергия уменьшается на величину

(4.24)

по сравнению с их энергией в отсутствие магнитного поля;

2) электроны с противоположной ориентацией магнитного момента. Энергия увеличивается на величину

. (4.25)

таким образом, происходит расщепление энергии не спаренных электронов во внешнем постоянном магнитном поле. Такое расщепление называется Зеемановским (рис. 4.20).

Если на образец, содержащий не спаренные электроны, находящиеся в постоянном магнитном поле, направить электромагнитное излучение с частотой ν при некотором значении энергии кванта излучения hν, будет выполняться условие:

(4.26)

Рис. 4.20. Энергетические уровни атома

При этом не спаренные электроны, находящиеся на более низком энергетическом уровне, переходят на верхний уровень (с одновременным изменением направления вращения спинов) и поглощают энергию электромагнитного излучения. Это поглощение может быть зарегистрировано в виде спектрограмм (рис. 4.21).

Рис. 4.21. Схема линий поглощения: а - сегментной; б - ее производной

В спектрологии используют электромагнитное излучение с ν=9000 МГц. Длина волны такого излучения равна 3 см; В=1000 мТл. Таким образом, поглощение энергии при совпадении частот электромагнитного поля с частотой фотона, которая соответствует разности энергии между подуровнями, называется магнитным резонансом. Магнитный резонанс выполняется при условии (4.26).

На основании этого выражения можно определить значение g-фактора. Зная его величину, можно определить характер магнетизма системы (спиновой или орбитальный), получить исчерпывающую информацию о полях и внутримолекулярных связях. Прибор, используемый для измерения какого-либо параметра колебательной системы, называется спектрометром (рис. 4.21).

Рис. 4.21. Схема ЭПР-спектрометра

ЭПР-спектрометр состоит из следующих частей: электромагнита 1, создающего сильное магнитное поле, индукция которого может плавно изменяться; генератора СВЧ 2; специальной "поглощающей линейки" 3, которая концентрирует падающее СВЧ-излучение на отрезке и позволяет обнаружить поглощение энергии образцом (объемный резонатор); электронной схемы 4, обеспечивающей наблюдение или запись спектров ЭПР; образца 5; осциллографа 6; блока питания.

Основными параметрами, характеризующими спектральную (одиночную) линию поглощения ЭПР, являются:

1) интегральная интенсивность (суммарная, поглощенная при ЭПР, энергия) - пропорциональна числуне спаренных электронов в образце, что позволяет наблюдатьза изменением концентрации свободных радикалов;

2) ширина спектральной линии - определяется разбросом энергетических уровней, занимаемых не спаренными электронами;

3) g-фактор - дает возможность судить о внутримолекулярных связях.

Метод ЭПР в биологии используется для:

1) обнаружения и исследования свободных радикалов. Так, в спектрах ЭПР облученных белков обнаружены свободные радикалы. Это позволило проследить образование свободных радикалов и изменения первичных и вторичных продуктов радиационного поражения;

2) изучения фотохимических процессов;

3) определения концентрации радикалов в воздушной среде.

Использование метода ЭПР при различных исследованиях, в том числе и медико-биологических, основано на том, что при получении спектра обнаруживается не одна линия поглощения, а целая группа линий, которые называются расщеплением. Существует как электронное расщепление (оно возникает, когда молекула или атом обладают вызывающим ЭПР), так и сверхатомные расщепления. По спектрам ЭПР можно найти положение спин-метки в биомолекуле. Вводя метки в различные участки молекул, можно установить расположение различных групп атомов, их взаимодействие, изучить переходы и ориентацию химических связей и т.д., что было сделано при изучении клеточных мембран.

4.5.5. Ядерный магнитный резонанс

Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) заключается в переориентации магнитных моментов ядер некоторых веществ: при поглощении в постоянном магнитном поле и при определенной частоте электромагнитных волн. Если имеется четное количество протонов и нейтронов, ЯМР не наблюдается. Ядра нуклона атома обладают магнитными свойствами, и их рассматривают как маленькие магнитики - диполи. Это связано с наличием у нуклонов спина. При наложении на такие ядра постоянного магнитного поля наблюдается явление, которое получило название «прецессия» (подобно названию "волчка"), то есть вращение вокруг оси, отклонение от вертикального положения. Такое движение определяется частотой ν, которая индивидуальна для каждого типа ядер, не зависит от напряженности постоянного магнитного поля. При действии на ядра, кроме постоянного, переменного магнитного поля собственной частотой прецессии ядерных диполей будет наблюдаться возбуждение данных ядер, что и считается как явление ЯМР. Возбуждение ядер сопровождается поглощением энергии до "насыщения", затем, после прекращения действия ВЧ-импульсов, возбужденные ядра излучают ранее поглощенную энергию в виде переменного магнитного поля, которое регистрируется. В индуктивной катушке (рис. 4.23) при этом регистрируется сигнал, который определяется как ЯМР-сигнал от объекта.

Рис. 4.23. Схема спектроскопа ЯМР: 1 - катушка с образцом; 2 - полюса с магнитом; 3 - ВЧ-генератор; 4 - усилитель; 5 - генератор модулирующего напряжения; 6 - катушка модуляции поля В; 7 – осциллограф

ЯМР наблюдается в том случае, когда на образец действуют магнитные поля: сильное, постоянное (с вектором индукции В) и слабое, радиочастотное с B₁ (10-100 Гц), то есть при таком излучении происходит переход ядра с одного энергетического уровня на другой.

4.5.6. Физическая характеристика клеточных мембран. Искусственные мембраны

На основе рассмотренных физико-химических методов доказано, что фосфолипиды в мембране клетки ведут себя подобно жидким кристаллам, то есть наблюдается строгая упорядоченность, текучесть и стабильность системы. Именно это сочетание обеспечивает выполнение мембранами их важнейших функций.

Фазовые переходы связаны с изменением энергии и потому могут быть обнаружены, в частности, по увеличению теплоемкости с изменением температуры.

Жидкокристаллические состояния бислоя имеют липидную вязкость и большую растворимость различных веществ, чем твердые состояния. Толщина жидкокристаллического бислоя меньше, чем твердого.

Структура молекул в жидком и твердом состоянии различна, в чем можно убедиться с помощью рентгеноструктурного анализа. Доказано, что в жидкой фазе молекулы фосфолипидов могут образовывать так называемые «клинки», в которые внедряются вещества. Перемещение «клинка» в этом случае приводит к диффузии молекулы. Строение биомембран и изучение их свойств оказалось возможным при использовании искусственных мембран (их физико-химических моделей).

Наибольшее распространение получили три таких модели.

К первой модели относится монослой фосфолипидов на границе раздела «вода – воздух» или «вода – масло». На таких границах молекулы фосфолипидов расположены так, что гидрофильные головки находятся в воде, а гидрофобные «хвосты» - в воздухе или масле. Если постепенно уменьшать площадь, занимаемую монослоем, то, в конце концов, удастся получить монослой, в котором молекулы расположены так же плотно, как и в одном из бислоев мембраны.

Второй моделью является бислойная липидная мембрана (БЛМ). Данная модель была создана в 1962 году Н. Мюллером. Сущность ее заключается в следующем: в тефлоновой перегородке, разделяющей два водных раствора, находящихся в стеклянном сосуде, сделали малое отверстие (d=1мм), которое заполняется фосфолипидом, растворенным в гептане. После того, как растворитель и излишки липида растекаются по тефлону, в отверстии образуется бислой толщиной несколько нанометров и диаметром около 1 мм. Расположив по обе части мембраны два электрода, можно измерить сопротивление мембраны или генерируемый на ней потенциал. Если по разные стороны перегородки поместить различные по химическому составу растворы, то можно изучать проницаемость мембраны для различных агентов.

К третьей модели относятся липосомы. Это мельчайшие пузырьки (визикулы), состоящие из билипидной мембраны и полученные обработкой смеси воды и фосфолипидов ультразвуком.

Липосомы представляют собой как бы биологическую мембрану, полностью лишенную белковых молекул. На липосомах проводят эксперименты по изучению влияния различных факторов на свойства мембраны. Как отмечалось, двойной фосфолипидный слой уподобляют конденсатору. На искусственных мембранах показано, что электроемкость 1 мм² мембраны составляет 5…13 нФ. Доказано, что мембраны выполняют две очень важные функции - матричную и барьерную, то есть мембраны являются основой удержания белков и защиты клетки от проникновения нежелательных элементов внутрь ее. Если эти функции мембран нарушаются, то происходит изменение нормального функционирования клеток и, как следствие, заболевание организма.

Таким образом, современное представление о клеточных мембранах базируется на физико-химических методах исследования. К таким методам относятся электронная микроскопия, рентгеноструктурный анализ, поляриметрия, ЭПР, ЯМР.

Жидкостные свойства мембраны клеток доказаны с помощью парамагнитных и флюорисцирующих меток, используемых при ЭПР и ЯМР. С помощью этих методов было доказано, что микровязкость клеточных мембран на три порядка выше вязкости воды и соответствует вязкости растительного масла. Как известно, с помощью рентгеноструктурного анализа и ЭПР доказано, что белки как бы плавают в «липидном море». Их молекулы погружены с двух сторон мембраны на разную глубину в двойной слой подвижных углеводородных «хвостов» - липидов. Имеются белки, проходящие через всю мембрану. В мембранах существуют каналы, по которым происходит транспорт малых ионов и молекул.

С помощью ЭПР и ЯМР доказано наличие конформационных переходов в мембранах. Структурные изменения обнаруживаются с помощью парамагнитных меток. В мембранах наблюдаются фазовые переходы и плавление липидов. Обнаружены продольные перемещения липидов и «флип-флоп», то есть перемещение вдоль и поперёк мембраны.

4.6. Проницаемость клеточной мембраны

Способность клеток пропускать через свою оболочку самые различные вещества называется проницаемостью. Проницаемость обусловлена тем, что клетка является открытой термодинамической системой и в ней постоянно осуществляется обмен веществ с окружающей средой. Изучение проницаемости клеток имеет огромное теоретическое и практическое значение, так как вся жизнедеятельность клеток связана с данным процессом, который участвует в распределении веществ, в генерировании биопотенциалов.

Особое значение имеет проницаемость для таких медицинских наук, как фармакология и токсикология. Для эффективного использования фармакологических средств при отравлениях необходимо знать особенности проникающей способности клеточных мембран.

Все виды переноса веществ через мембрану можно разделить на пассивный и активный транспорт.

4.6.1. Пассивный транспорт веществ

Пассивный транспорт осуществляется за счет энергии, сконцентрированной в каком-либо градиенте, и всегда происходит по направлению градиента от более высокого уровня к более низкому. таким образом, пассивный транспорт осуществляется в результате диффузии веществ в сторону меньшего электрического потенциала без затраты химической энергии.

Принято различать следующие типы пассивного переноса веществ (включая ионные) через мембраны (рис. 4.24):

1) простая диффузия;

2) перенос через поры (каналы);

3) транспорт с помощью переносчиков за счет:

а) диффузии переносчика вместе с веществом в мембране - подвижный переносчик;

б) эстафетной передачи вещества от одной молекулы переносчика к другой. Молекулы переносчика в данном случае образуют временную цепочку поперек мембраны.