ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Инженерная энзимология - это отрасль биотехнологии, базирующаяся на использовании каталитических функций ферментов (или ферментных систем) в изолированном состоянии или в составе живых клеток для получения соответст­вующих целевых продуктов. Биообъект здесь - фермент (или комплекс ферментов).

Развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной чистых ферментных препаратов, неустойчивостью их при хранении и невозможностью многократного использова­ния. Принципиально новые перспективы открылись перед при­кладной энзимологией в 60-е годы XX в. в результате появления на стыке химии и биологии новой отрасли - инженерной энзи­мологии. Ее задачи заключаются в развитии прогрессивных мето­дов выделения ферментов, их стабилизации и иммобилизации, а так же разработке научных основ их применения. Слово "инженерная" здесь привносит свою специфику, заключающуюся в акценте на целенаправленное создание конструкции (от франц. engin - машина), в данном случае - на конструирование молекул ферментов-биокатализаторов с задан­ными свойствами, более эффективных, чем существующие в природе, с последующим использованием в биотехноло­гическом процессе.

Классические методы селекции и мутагенеза (отбор случайных мутаций, индуцированный мутагенез) малопригодны для решения этой задачи, т. к. изменения генома, а значит и аминокислотные замены в молекулах ферментов будут носить случайный, неконтролируемый характер. Химическая модификация аминокислотных остатков в белковой молекуле чрезвычайно сложна и реально можно заменять только концевые остатки аминокислот (химическая трансформация свиного инсулина в человеческий).

Получение ферментов с заданными свойствами стало возможно только после возникновения науки-генетической инженерии и одного из ее направлений, получившего название - технология направленного мутагенеза. При осуществлении направленного мутагенеза, в отличие от классической генетической инженерии, осуществляется не введение или замена целого гена в хромосоме, а избирательно заменяются одна или несколько пар нуклеотидов в гене, отвечающим за синтез нужного фермента. Такая замена нуклеотидов приводит к такой же определенной замене остатков аминокислот в белковой молекуле, а это в свою очередь изменяет субстратную специфичность и физико-химические свойства фермента. Так, замена остатка глутамина-102 в молекуле лактатдегидрогеназы на аргинин превратила фермент в высокоактивную малатдегидрогеназу. Описанным способом получены термостабильные формы лизоцима Т-4 и субтилизина (каталитическая константа субтилизина изменена в 100 раз), созданы гибридные формы фер­ментной системы, ценной в иммуноферментном анализе, сочета­ющие в себе свойства β-галактозидазы и β -галактокиназы.

Поскольку число вариантов таких замен огромно, то для достижения нужного результата (повышения активности и стабильности фермента) необходимо знать аминокислотный состав, трехмерную пространственную структуру и свойства модифицируемой белковой молекулы, а так же пространственную структуру молекулы субстрата.

Основная сложность заключается в том, что не всегда известно, какую аминокислоту или последовательность аминокислот нужно изменить, чтобы получить белок с нужными свойствами. Изменения могут затрагивать аминокислотные остатки, расположенные в разных участках полипептидной цепи, которые потом сближаются при укладке белковой молекулы. Выбор аминокислоты, подлежащей замене, как правило, производится эмпирически, с учетом ее роли в функционировании белка. Данные об этом получают в ходе биохимических исследований или в методом рентгеноструктурного анализа трехмерной структуры белка или лучше комплекса белок - лиганд(субстрат). Поэтому положительный результат пока достигается достаточно редко.

В последнее время значительное развитие получил перспективный подход к получению высокоактивных белков, основанный на использовании методов компьютерного молекулярного дизайна (технология молекулярного докинга). В качестве примера можно привести работу сотрудников биологичекого факультета МГУ по созданию эффективных биокатализаторов-ферментов, значительно превосходящих природные аналоги.

В качестве модели был взят фермент пенициллинацилаза из Е. Coli, который широко применяется в фармацевтических производствах для получения полусинтетических пенициллинов. Его химическая и пространственная трехмерная структура установлена уже довольно давно. С помощью специально разработанной компьютерной программы было смоделировано улучшение свойств этого фермента. Для повышения активности и специфичности фермента виртуально варьировались (заменялись) аминокислотные остатки его активного центра, которые участвуют в связывании субстрата. Для каждой мутации проверялось (виртуально, методом молекулярного докинга) сродство новой формы активного центра фермента к субстрату. Мерой сродства служила расчитанная величина энергии связывания субстрата с виртуальной молекулой фермента. Всего было виртуально проскринировано более 3000 мутантных форм фермента, несущих произвольные одиночные и двойные мутации, среди которых были обнаружены мутантные формы, связывающие субстрат почти в 100 раз лучше природного фермента. Далее зная структуру такого высокоэффективного мутанта можно искусственно сконструировать фрагмент ДНК, кодирующий его аминокислотную последовательность и в дальнейшем клонировать и получить его в подходящем организме – хозяине.

В настоящее время подобные исследования являются достаточно дорогими и трудоемкими и в основном еще не вышли за рамки научных лабораторий. Есть надежда, что уже в ближайшем будущем развитие протеомики, аналитической и компьютерной техники позволит точно и быстро предсказывать свойства того или иного белка, исходя из данных о его аминокислотной последовательности. Это значительно упростит процедуру искусственного создания нужных белков с заданными свойствами.

Важным этапом развития инженерной энзимологии стала раз­работка способов получения и использования иммобилизованных ферментов.