ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК

Рассмотренные выше методы иммобилизации универсальны для всех видов иммобилизованных биокатализаторов - индивидуальных ферментов, клеток, субклеточных структур, комбинированных препаратов.

Несмотря на все преимущества иммобилизованных ферментов перед неиммобилизованными их широкое применение сдерживается несколькими отрицательными факторами.

1. Прежде всего это высокая стоимость получения таких препаратов. Фермент сначала нужно получить, выделить его в чистом виде и затем провести процедуру иммобилизации.

2. Многие ферменты-протеиды, содержащие коферментные группы или кофакторы невозможно выделить в чистом виде без потери активности.

3. Процессы иммобилизации, как правило, проводятся вслепую и часто сопровождаются снижением активности фермента.

4. Любой фермент способен осуществить лишь определенное число актов катализа, после чего он выходит из строя. Поэтому такие катализаторы обладают коротким сроком действия, после чего их нужно заменять. С учетом высокой стоимости иммобилизованных ферментов это во многих случаях сводит на нет преимущества их использования.

Поэтому, наряду с иммобилизацией ферментов в последнее время все большее внимание уделяется иммобилизации клеток и субклеточных структур. Это объясняется тем, что при использовании иммобилизованных клеток отпадает необходимость выделения и очистки ферментных препаратов, а непрерывное воспроизводство клеткой своих ферментов позволяет осуществлять процессы в течение длительного времени. Кроме того иммобилизация клеток на крупных частицах носителя позволяет легко отделять их на завершающей стадии от культуральной жидкости без повреждений с сохранением асептики. Это позволяет использовать такие клетки многократно и отказаться от сложной и трудоемкой операции предварительной наработки биомассы продуцента.

Использование иммобилизованных клеток имеет и целый ряд недостатков:

1. Иммобилизованная живая клетка в отличие от молекулы фермента нуждается в питательной среде и выделяет различные метаболиты, что приводит к загрязнению целевого продукта.

2. Аэробные клетки нуждаются в кислороде и выделяют углекислый газ. Поэтому такой ферментер необходимо снабжать системами аэрирования, отвода газов и пеногашения, что усложняет и удорожает его конструкцию.

3. Растущие в размерах и делящиеся клетки разрушают структуру носителя. Образующиеся при делении дочерние клетки, покидая носитель, загрязняют целевой продукт. Поэтому в промышленных процессах для иммобилизации чаще используют покоящиеся клетки или споры бактерий. Для подавления роста иммобилизованных клеток растений используют дефицит фитогормонов, а рост клеток бактерий тормозят добавлением антибиотиков.

4. Большинство клеточных ферментов являются эндометаболитами, т.е. локализованы внутри клетки. Поэтому трансформируемый субстрат сначала должен проникнуть в клетку через клеточную стенку, а это не всегда возможно. В этом случае приходиться использовать клетки с частично поврежденной клеточной стенкой, а это значительно сокращает срок их жизни, а значит и срок работы биокатализатора.

Поэтому выбор между использованием иммобилизованных или неиммобилизованных клеток или ферментов для каждого конкретного процесса осуществляют исходя из нескольких основных критериев:

1. Особенности процесса (одностадийный или многостадийный, известен или не известен механизм процесса и отвечающий ему фермент и т. д.).

2. Значимость для человека (потребительская стоимость продукта). Если продукт является жизненно важным лекарством, дорогим и труднодоступным, то следует использовать вариант процесса, позволяющий получить этот продукт в максимально большом количестве. Себестоимость в этом случае не является решающим фактором.

3. Если продукт крупнотоннажный с низкой себестоимостью, то основным критерием выбора будет максимальная дешевизна получения.

Иммобилизованные ферменты и клетки микроорганизмов применяют для биотрансформации органических соединений, разделения рацемических смесей, гидролиза ряда сложных эфиров, инверсии сахарозы, восстановления и гидроксилирования стероидов. Иммо­билизованные хроматофоры используют в лабораторных установках для синтеза АТФ, а пурпурные мембраны - для создания искусственных фотоэлектрических преобразователей - аналогов солнечных батарей. Разрабатывается реактор на основе иммобилизованных клеток дрожжей для получения этанола из мелассы, в котором дрожжи сохраняли бы способность к спиртовому броже­нию в течение 1800 ч. Из более чем 2000 известных в настоящее время ферментов иммобилизована и используется для целей ин­женерной энзимологии примерно десятая часть (преимуществен­но оксидоредуктазы, гидролазы и трансферазы).

Для осуществления химических процессов с помощью иммо­билизованных ферментов и клеток применяют колоночные, трубчатые, пла­стинчатые и танкерные реакторы разного объема и производи­тельности. Иммобилизованные биокатализаторы функциони­руют в биореакторе в виде неподвижной фазы, через которую про­текает среда с субстратом, подлежащим химическому превраще­нию (гетерогенный катализ). В таких реакторах наряду с непрерыв­ным режимом используется и периодический. Для эффективного перемешивания и газообмена биореактор снабжают мешалкой. По­вреждающее действие мешалки на биокатализатор устраняют, зак­репляя определенным образом его гранулы. Например, в биореак­торе «корзиночного» типа мешалка вращается в полом цилиндре из сетчатой структуры (корзина), в ячейках которой закреплен им­мобилизованный фермент. Во внутреннем объеме трубчатых реак­торов рыхло расположены полые волокна, заполненные биоката­лизатором. Степень превращения субстрата в продукт (например, фумарата аммония в аспартат) в таких реакторах достигает 90 %.