СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ 7 глава

Таблица 3.5. Мембранные молекулы — регуляторы активности компонентов комплемента

C2b инактивируется двумя белками: сывороточным C4–связывающим белком — C4BP (C4–Binding Protein) и мембранным белком DAF (Decay–Accelerating Factor — фактор, ускоряющий деградацию). Оба эти ингибитора конкурируют с C2b за связывание с C4b. В комплексе с C4BP C4b становится высокочувствительным к деградации с участием сывороточной протеазы (фактора I), расщепляющей C4b на C4c и C4d. Подобным образом два других регуляторных белка: сывороточный фактор H и мембранный CR1 — «поступают» с C3b: они вытесняют собой C2b из комплекса с C3b, делая тем самым C3b доступным для деградации фактором I. Фактор H имеет также химическое сродство для связывания с сиаловыми кислотами, которых много на поверхности клеток млекопитающих, но которых не бывает у большинства бактерий.

Ещё один регуляторный мембранный белок MCP связывает C3b и делает его доступным для деградации фактором I.

У всех регуляторных белков системы комплемента, связывающих C4b и C3b, в первичной последовательности АК присутствуют общие (консенсусные) короткие повторы, характерные именно для комплементконтролируюших белков.

Активность белков комплекса атаки на мембрану также сдерживается мембранными белками собственных клеток CD59 и DAF. Оба они связаны с мембраной клетки через фосфатидил-инозитол-гликолипид. Существует наследственное заболевание человека с дефектом именно в формировании такой фосфатидил–инозитол–гликолипидной связи — пароксизмалъная ночная гемоглобинурия. У таких больных эпизодически возникают приступы внутрисосудистого лизиса собственных эритроцитов активированным комплементом и соответственно происходит экскреция гемоглобина почками.

Лектиновый путь активации комплемента начинается со связывания с углеводами поверхностных структур микробных клеток, а именно с остатками маннозы, такого нормального белка сыворотки крови как связывающий маннозу лектин — СМЛ. У млекопитающих имеется специальная СМЛ–ассоциированная сериновая протеаза, которая аналогично C1s классического пути катализирует активационное расщепление C4. Дальнейшие реакции лектинового пути активации те же, что и при активации по классическому пути.

3.3. Белки острой фазы (C–реактивный белок, связывающий маннозу лектин, сурфактанты)

Белками острой фазы называют несколько белков сыворотки крови, концентрация которых значительно возрастает при патологических процессах, затрагивающих организм в целом. К белкам острой фазы относят фибриноген, СРБ, связывающий маннозу лектин (СМЛ), сурфактанты SP–A и SP–D, у грызунов — ещё сывороточный амилоид. Главное анатомическое место синтеза белков острой фазы — печень. Биохимическим сигналом для повышенного синтеза белков острой фазы служит появление в системной циркуляции цитокинов доиммунного воспаления — ИЛ–6 и опосредованно — TNFa и ИЛ–1, что бывает при тяжёлых системных воспалительных процессах.

Значительные количества этих белков появляются в крови в течение первых 2 дней развития острого процесса, когда специфических АТ ещё нет, последние смогут возникнуть лишь спустя 5–7 дней. В этот ранний период СРБ и СМЛ связывают широкий спектр микробов и опсонизируют их для фагоцитоза и/или лизиса с участием комплемента, т.е. СРБ и СМЛ являются растворимыми Рц — PRR, распознающими патогенов во внутренней среде.

Название «C–реактивный белок» (СРБ) происходит из наблюдения, что этот белок связывает стафилококки группы С. Со временем накопились сведения о том, что СРБ способен связывать в силу своих биохимических свойств ряд бактерий и «отправлять» их на «съедение» фагоцитам. Такое явление, когда связывание микроба в комплекс с неким растворимым белком обеспечивает возможность поглощения этого микроба клеткой–фагоцитом, называют опсонизацией (от лат. opsonen — делающий вкусным). Растворимые белки, способные одной своей стороной связать микроб, а второй стороной — специальный Рц (к себе) на клетке–фагоците, называют опсонинами. У млекопитающих в сыворотке крови известно несколько различных по биохимической природе опсонинов: это СРБ, СМЛ, компонент комплемента C3 и самые многочисленные по разнообразию связываемых микробов иммуноглобулины — АТ — продукты биосинтеза B–лимфоцитов.

СРБ относят к семейству пентраксинов. Пентраксинами называют белки, молекула которых сформирована из 5 одинаковых СЕ. СРБ имеет химическое сродство к фосфорилхолину. Последний входит в состав клеточных стенок ряда бактерий и одноклеточных грибов. По этой причине СРБ способен связывать соответствующие микробные клетки. Фосфорилхолин, входящий в состав фосфолипидов мембран клеток млекопитающих, находится в такой форме, с которой СРБ не связывается. Связав бактерии, СРБ осуществляет два действия: первое — опсонизирует бактерии для фагоцитоза, и второе — активирует каскад комплемента, так как связывает надлежащим образом компонент C1q — первый инициирующий компонент классического пути активации комплемента. Таким образом, не будучи иммуноглобулином, по разрушающим микроб эффекторным механизмам СРБ действует отчасти аналогично АТ, только в отличие от АТ этот белок не вариабелен и способен связывать широкое, но ограниченное множество патогенов. СРБ связывает молекулу C1q за иное место, чем иммуноглобулины: СРБ — за коллагеноподобную часть молекулы, иммуноглобулины — за глобулярные структуры молекулы C1q. Но каскад комплемента запускается тот же самый.

Связывающий маннозу лектин (СМЛ) — кальцийзависимый сахарсвязывающий белок (лектинами по определению называют именно белки, способные с высокой аффинностью связывать углеводы). СМЛ относят к семейству коллектинов. СМЛ связывает остатки маннозы, которые экспонированы на поверхности многих микробных клеток, но экранированы, если присутствуют, в поверхностных углеводах клеток млекопитающих. СМЛ опсонизирует микробные клетки для фагоцитоза моноцитами, которые в отличие от более зрелых макрофагов ещё не экспрессируют собственный Рц для маннозы. Как ни странно, не имея гомологии в АК–последовательности, по вторичной структуре СМЛ похож на C1q. Похож он на C1q и по функции, а именно, связав микробную клетку, СМЛ приобретает способность активировать протеазы, производящие активационное расщепление C4 и C2, что инициирует каскад комплемента. Это и называют лектиновым путём активации системы комплемента.

Помимо СМЛ, к семейству коллектинов принадлежат также белки сурфактанта лёгких — SP–A и SP–D (surfactant proteins A, D). Эти белки, вероятно, имеют существенное значение в опсонизации такого лёгочного патогена как одноклеточный гриб Pneumocystis carinii.

3.4. Фагоцитоз

И.И. Мечников, занимаясь сравнительной эмбриологией и гистологией морских беспозвоночных, в 1882 г. открыл существование особого процесса в их организмах: определённые клетки, целомоциты или амебоциты, поглощали инородные частицы и в том числе микроорганизмы, попадающие во внутреннюю среду. Вокруг более крупных инородных тел эти клетки формировали отграничивающие гранулемы. Собственно открытие И.И. Мечникова состояло не в наблюдении поглощения клетками инородных частиц, а в осознании защитного значения этого процесса для всего организма, а не понимание его как пищеварительного для данной единичной клетки. Подобные процессы наблюдали и другие врачи и исследователи, в том числе в препаратах из очагов гнойного воспаления у людей, где особые белые клетки крови (лейкоциты), как амебы поглощали микроорганизмы и переваривали их внутри себя. Но принято было думать, что эти клетки болезнетворные, ибо видели их в больном месте — в очагах гнойного воспаления. Коллеги — современники И.И. Мечникова оценили его прозрение ни много ни мало как мысль гиппократовского масштаба. И.И. Мечников назвал эти клетки «пожирающими». А. Гроббен и Ф. Гейдер подсказали ему греческие корни, составившие термин «фагоциты».

Любая живая клетка, в том числе и организма млекопитающих, поглощает вещества из внешней среды через специальные каналы для метаболитов в мембране, эндоцитозом отдельных молекул, пиноцитозом. Однако фагоцитоз — это особый процесс поглощения клеткой крупных макромолекулярных комплексов или корпускулярных структур.

«Профессиональными» фагоцитамиу млекопитающих являются всего два типа дифференцированных клеток — нейтрофилы и макрофаги. Фагоцит обхватывает своей мембраной поглощаемый объект (бактериальные или собственные повреждённые клетки, или иное), заключает его в мембранную везикулу, которая оказывается внутри фагоцита. Такие везикулы называют фагосомами. Цель фагоцитоза — полное биохимическое расщепление до мелких метаболитов содержимого фагосомы. Для этого у фагоцита есть специальные внутриклеточные органеллы — лизосомы, содержащие набор гидролитических ферментов с оптимумом pH примерно 4,0. В клетке фагосомы сливаются с лизосомами в фаголизосому, где и происходят реакции расщепления поглощённого материала. Кроме лизосом, в фагоцитах есть специальные ферментные системы: НАДФ–Н–оксидазы, супероксиддисмутаза, NO–синтазы, которые генерируют активные формы неорганических окислителей, — перексид водорода (Н₂О₂), супероксид анион (О₂^–), синглетный кислород (¹O₂), радикал гидроксила (OH^–), гипохлорид (ОСl), оксид азота (NО⁺). Эти агрессивные окислители работают внутри клетки, а также на определённых этапах развития воспалительной реакции секретируются во внеклеточную среду.

Нейтрофилы и моноциты созревают в костном мозге из стволовой кроветворной клетки и имеют общую промежуточную клетку–предшественницу. Нейтрофилы циркулируют в периферической крови и составляют бoльшую часть лейкоцитов крови — 60–70%, или 2,5–7,5´10⁹ клеток в 1 л крови. В норме нейтрофилы не выходят из сосудов в периферические ткани, но они первыми «бросаются» (т.е. подвергаются экстравазации) в очаг воспаления. Моноциты, напротив, являются «транспортной формой», в крови их 5–10% от общего числа лейкоцитов. Их предназначение — стать и быть оседлыми макрофагами в периферических тканях. Макрофаги локализуются в рыхлой соединительной ткани, подстилающей все покровные ткани, а также в паренхиме органов и по ходу кровеносных сосудов. Макрофаги печени называют купферовскими клетками (звездчатые ретикулоэндотелиоциты), макрофаги мозга — микроглией, макрофаги лёгких — альвеолярными и интерстициальными.

Как фагоциты «узнают», чтo им следует фагоцитировать? На доиммунном этапе защитных реакций распознающие возможности фагоцитов ограничены. И только иммунный механизм в виде синтеза АТ «приводит» к макрофагу доступное АТ разнообразие распознаваемых Аг.

Известно 5 структур — Рц на клеточной мембране макрофагов, связывающих то, что макрофаг потенциально способен поглотить по механизму фагоцитоза.

· Рц для комплемента — CR3 (интегрин CD11b/CD18) и CR4 (интегрин CD11c/CD18). Эти интегрины мембраны макрофагов, кроме компонентов комплемента, имеют химическое сродство и, следовательно, связывают ряд бактериальных продуктов: липополисахариды, липофосфогликан Leishmania, гемагглютинин из филаментов Bordetella, поверхностные структуры дрожжевых клеток родов Candida и Histoplasma.

· На тканевых макрофагах (не на моноцитах крови) есть Рц, связывающий маннозу. Такого Рц нет на других фагоцитах — нейтрофилах.

· Молекула CD14 на макрофагах — Рц для комплексов бактериальных липополисахаридов (ЛПС) с липополисахаридсвязывающим протеином сыворотки.

· Рц для производных лигандов сиаловых кислот (углеводов, характерных для клеток млекопитающих). Их называют «scavenger receptor» — Рц для «уборки мусора» (погибающих и деградирующих собственных клеток).

· Рц для «хвостов» (Fc–фрагментов) IgG — FcgRI — Fcg–Рц 1–го типа. Это как раз место сопряжения лимфоцитарного разнообразного по Аг иммунитета с эволюционно более древним механизмом защиты — фагоцитозом. В CD–номенклатуре эту поверхностную молекулу макрофагов называют CD64, и поскольку она экспрессирована только на моноцитах/макрофагах, она является мембранным маркёром клеток этой линии дифференцировки. Подклассы IgG по силе связи с FcgRI располагаются в следующем порядке: IgG3 >IgG1 >IgG4 >IgG2.

Второй механизм сопряжения лимфоцитарного иммунитета с фагоцитами состоит в том, что на мембране фагоцитов есть молекулы — Рц для активных цитокинов, вырабатываемых иммунными лимфоцитами. Через них фагоцит воспринимает сигнал от лимфоцита, и в результате происходят существенные сдвиги во внутренней «энергетике» фагоцита. Через Рц к g–ИФН и к фактору некроза опухолей (TNF) после связывания с лигандом макрофаг претерпевает сильную активацию всей своей внутренней «биохимической машины». Через Рц для ИЛ–10 макрофаг, напротив, инактивируется. Есть на макрофагах (но не на нейтрофилах) и мембранные молекулы для контактов с комплементарными мембранными молекулами лимфоцитов, т.е. для непосредственных межклеточных взаимодействий (это CD40, B7, MHC–I/II).

Назовем ещё два маркёра моноцитов/макрофагов: это CD115 — Рц для фактора роста моноцитов M–CSF (колониестимулирующий фактор моноцитов) и CD163 (Рц гемоглобина типа скевенджер, от англ. scavenger — мусорщик).

На нейтрофилах идентифицированы эксклюзивные маркёры наружной мембраны — CD66A и CD66D. Функциональные «нагрузки» этих молекул пока неизвестны. По биохимическим свойствам они попадают в семейство так называемых раково–эмбриональных белков.

Что происходит после того, как фагоцит поглотил объект извне в виде заключенного в мембрану пузырька — фагосомы? Происходят по крайней мере три процесса: расщепление поглощённого материала внутри фагоцита, продукция и секреция в межклеточное пространство литических ферментов и окислительных радикалов, продукция и секреция цитокинов.

Первый из них — расщепление того, что фагоцитировано, до мелких продуктов метаболизма, которые клетка и вслед за ней организм способны вывести через природные системы выделения (почки и ЖКТ). Этот процесс идёт по одинаковым биохимическим механизмам и в нейтрофилах, и в макрофагах. Для этого у фагоцитов есть специальный «аппарат» литических ферментов (кислых протеаз и гидролаз), заключенных в особые органеллы — лизосомы; pH в лизосомах около 4. Мембрана фагосомы сливается с мембраной лизосомы, предоставляя лизосомным ферментам доступ к фагоцитированному веществу.

В гранулах нейтрофилов содержатся литические ферменты, которые активированный нейтрофил в очаге выбрасывает в межклеточное вещество. Это коллагеназа, катепсин G, желатиназа, эластаза, фосфолипаза A₂.

Кроме этого, у фагоцитов есть специальные системы ферментов, генерирующие образование реакционно-способных свободных радикалов кислорода (супероксидного аниона О₂^–, синглетного кислорода ¹O₂), а также пероксида водорода. Фермент NO–синтаза генерирует образование радикала оксида азота (NO⁺). Эти радикалы осуществляют деструктивные реакции применительно к фагоцитированному объекту. Но, кроме того, фагоцит секретирует их в окружающую межклеточную среду, где они оказывают травмирующее действие, в том числе и на собственные ткани (табл. 3.6).

Таблица 3.6. Бактерицидные биохимические механизмы фагоцитов и «встречные» биохимические механизмы «сопротивления» микроорганизмов, обеспечивающие выживание и даже размножение микробов внутри фагоцитов макроорганизма

* На примере бактерий Salmonella typhimurium (возбудитель брюшнотифозной лихорадки) и Mycobacterium tuberculosis (возбудитель туберкулёза). У S. typhimurium в ранние сроки имеет значение метаболическое противодействие бактерий кислородзависимым бактерицидным механизмам фагоцитов, в поздние — азотзависимым бактерицидным механизмам. У М. tuberculosis имеют значение оба метаболических механизма выживания внутри фагоцитов, но более существен механизм устойчивости к азотзависимой атаке фагоцитов.

Макрофаги и нейтрофилы, активированные микробными продуктами, начинают продуцировать цитокины и другие биологически активные медиаторы. Макрофаги продуцируют интерлейкины (ИЛ–1, ИЛ–6, ИЛ–8, ИЛ–12), фактор некроза опухоли a (TNF–a), а также простагландины, лейкотриен В₄ (LTB₄) активирующий тромбоциты фактор (ФАТ). Нейтрофилы продуцируют TNF–a и ИЛ–12, а также хемокин ИЛ–8. Кроме того, нейтрофилы вырабатывают LTB₄ и ФАТ.

Названные медиаторы из фагоцитов создают в очаге внедрения внешних субстанций доиммунное воспаление в барьерной ткани, которое обеспечивает активацию кровеносных сосудов, дендритных клеток и лимфоцитов, «подготавливающую» возможность развития лимфоцитарного иммунного ответа.

Только в макрофагах (в нейтрофилах нет) происходят образование внутри клеток комплексов из продуктов расщепления фагоцитированного вещества с собственными молекулами MHC–II и экспрессия этого комплекса на поверхность клетки с «целью» представления Аг для распознавания T–лимфоцитами. Таким образом, макрофаги способны осуществлять функции АПК.

Без лимфоцитарного иммунитета, т.е. без лимфоцитов и их продуктов — цитокинов и АТ, защитные санирующие возможности фагоцитоза, однако, ограничены. Во-первых, доиммунное воспаление в ответ на распознавание и поглощение патогенного материала в целом количественно слабое, «холодное», не мощное. Микроорганизмы земной биосферы эволюционировали (и продолжают эволюционировать) таким образом, что многие из них «не боятся» фагоцитов, многие способны жить и размножаться именно в макрофагах: это микобактерии, сальмонеллы, лейшмании, листерии, трипаносомы, легионеллы, криптококки, гистоплазмы, иерсении, простейшие, риккетсии, вирусы, в том числе ВИЧ. Поэтому позвоночным для выживания «понадобилась» система защиты от инфекций более сильная, чем просто фагоцитоз. Во-вторых, фагоциты только расходуются в конкретной защитной реакции, они не пролиферируют и им не дано «запоминать» патоген, т.е. никакого усиленного «иммунитета» в отношении повторного проникновения того же патогена в организм на уровне фагоцитов не создаётся. Это уникальное свойство приобрели в эволюции только лимфоциты. И может быть, это — главный параметр позитивного естественного отбора, закрепившего лимфоцитарный иммунитет у многоклеточных, начиная с челюстных рыб.

Однако в ряде ситуаций нельзя недооценивать, например, патофизиологические последствия доиммунной активации нейтрофилов непосредственно микробными продуктами. Так, при инфекции Toxoplasma gondii летальный некроз печени в первые 24–48 ч обусловлен «цитокиновым взрывом» именно из нейтрофилов. На нейтрофилах, как и на макрофагах, экспрессирован Рц CD14, который связывает комплексы ЛПС с ЛПC–связывающим протеином сыворотки (LBP), а также комплексы ЛПС с другими микробными продуктами (например, с эндотоксинами).

Нейтрофилы — самые многочисленные из белых клеток в циркулирующей крови. Они первыми мигрируют из сосудов в очаг поражения в ткань [за счёт быстрой экспрессии нужных молекул адгезии — VCAM–1 (лиганд на эндотелии VLA–4) и CD11b/CD18 (лиганд на эндотелии ICAM–1)]. Например, всего за 1 ч после введения в перитонеальную полость мыши сублетальной дозы Toxoplasma gondii число нейтрофилов в перитонеальной полости возрастает с 2 до 25% от общего числа лейкоцитов. В очаге они быстро активируются и секретируют радикалы кислорода и литические ферменты. Связывание лиганда с Рц CD14 на нейтрофилах активирует довольно интенсивную выработку нейтрофилами TNF–a и ИЛ–12.

Моноклональные АТ RDC6.8C5 к молекуле Gr–1, экспрессированной на нейтрофилах и эозинофилах мыши, при введении in vivo обладают свойством эффективно элиминировать гранулоциты, что позволяет использовать их в модельных экспериментах. Например, введение мышам D–галактозамина индуцирует экспрессию на клетках печени Рц для TNF–a. Если таким образом предобработанным мышам затем ввести надлежащую дозу лизата Toxoplasma gondii, то через 24–48 ч произойдёт массивная гибель клеток печени по механизму TNF–a-индуцированного апоптоза и смерть животных. Если же мышам перед введением лизата Toxoplasma gondii ввести антинейтрофильные АТ, то печень останется цела и мыши будут живы. Это свидетельствует о том, что нейтрофилы являются источником «взрывного выброса» TNF–a в ответ на попадание в организм больших количеств Аг Toxoplasma gondii. Вообще же нейтрофилы прямо реагируют на продукты следующих возбудителей инфекционных заболеваний: Toxoplasma gondii, виды Plasmodium и Leishmania, Trypanosoma cruzi, Pneumocystis carinii, Cryptosporidium parvum, Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocytogenes, Candida albicans.

3.5. Эндогенные пептиды–антибиотики

Это одно из самых новых направлений исследований — изучения особых веществ — пептидов, состоящих из 13–80 АК, которые синтезируются с неких генов эукариотических клеток и обладают активностью антибиотиков, т.е. способны убивать бактерии. Функциональные пептиды образуются в клетке путём процессинга более крупных молекул белков–предшественников. Пептиды–антибиотики обнаружены в клетках растений, насекомых, лягушек, а также млекопитающих животных (кроликов, свиней, коров) и человека. По структуре пептиды–антибиотики разделяют на 3 группы.

· I группа — линейные пептиды a–спиральной структуры, не содержащие цистеина. К ним относят цекропины высших насекомых, оболочечников и свиней, магаинин и темпорины лягушек.

· II группа — пептиды, содержащие несколько цистеинов, между которыми установлены 1–4 дисульфидные связи. К ним относят пептид из кожного секрета лягушки, тахиплезины краба, протегрины свиньи, а также дефензины, содержащие 3 дисульфидные связи. a–Дефензины синтезируют и содержат в гранулах нейтрофилы. b–Дефензины синтезируют клетки покровных тканей — эпителий дыхательных путей и ЖКТ.

· III группа — пептиды, в составе которых содержится необычно много какой–либо одной или двух АК, чаще всего пролина или аргинина либо триптофана и глицина. Примером пептидов этой группы являются апидецины медоносной пчёлы. Сюда же относят 39–членный пептид (PR–39) нейтрофилов свиньи и его более крупные аналоги из нейтрофилов коровы.

Генетические дефекты пептидов–антибиотиков или необходимых для их функционирования кофакторов (например, ионных каналов, так как активность пептидов–антибиотиков «высокочувствительна» к ионной силе), возможно, коррелируют с развитием прогредиентно–текущей хронической патологии с инфекционными факторами в этиологии.

3.6. Интерфероны типа I

Существуют и факторы доиммунной защиты от вирусов — интерфероны (ИФН), а именно ИФНa и ИФНb, или интерфероны типа I. В настоящее время исследователи пришли к заключению, что основным клеточным источником выработки ИФН типа I в организме являются лимфоидные дендритные клетки. ИФН — это небольшие белки, которые вырабатывают уже инфицированные вирусом клетки. Индуктором синтеза ИФН служат молекулы двуспиральной РНК. Двуспиральная РНК может представлять собой геномную РНК вирусов или являться промежуточным продуктом транскрипции у ДНК-содержащих вирусов. В клетках млекопитающих собственных двуспиральных РНК нет. ИФН индуцируют биосинтез в клетке необычных ферментов, повреждающих репликативный цикл вирусов:

· олигоаденилат синтетаза, полимеризующая АТФ в 2'–5'-олигомеры (в норме нуклеотиды в нуклеиновых кислотах связаны по 3'–5'). Аномальные 2'–5'–олигомеры активируют эндорибонуклеазу, которая расщепляет их и заодно вирусные нуклеиновые кислоты;

· серинтреониновая киназа Р1 фосфорилирует фактор инициации синтеза белка эукариот eIF–2, что приводит к подавлению трансляции, в том числе и вирусных белков;

· белок MX — некий клеточный белок, о котором известно, что он необходим для проявления резистентности клетки к размножению в ней вируса гриппа (по данным генетического нокаута гена Мх).

Сводная характеристика факторов доиммунной резистентности к инфекциям приведена в табл. 3.7.

Таблица 3.7. Факторы доиммунной резистентности к инфекциям

Примечания. К — конститутивный биосинтез, И — индуцибельный биосинтез