Электрофорез. Описание и методы

Электрофорез - это движение заряженных молекул в электрическом поле. Эти молекулы ведут себя предсказуемым образом: положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному полюсу, а отрицательно заряженные - к положительному. На практике этот метод позволяет эффективно отделять молекулы от смешанного раствора.

Электрофорез классифицируется в зависимости от среды, в которой происходит движение; на самом базовом уровне это либо раствор, либо твердое тело. Методы также различают по их аналитическому (качественное или количественное определение молекул) или препаративному (выделение и очистка молекул) характеру, а также по типу разделяемых молекул. В биохимических приложениях в целом и в антропологической генетике (см. Антропологическая генетика) в частности, методы электрофореза используются для аналитического разделения ДНК, РНК или белков, обычно по длине, на твердой матрице (геле) в водном ионном растворе.

Эксперименты по электрофорезу начались еще в девятнадцатом веке. В начале XX века ученые обнаружили, что различные биомолекулы имеют электрические заряды, которые приводят к предсказуемой миграции в электрическом поле. В 1930-х годах шведский химик Арне Тизелиус разработал метод электрофореза растворов для разделения белков сыворотки крови (Tiselius 1937), за что получил Нобелевскую премию по химии. Однако растворные методы страдают от возникновения конвекционных токов, которые препятствуют электрофорезу, если молекулы не стабилизировать (Viovy 2000). В 1950-х и 1960-х годах электрофорез начали проводить в синтетических гелевых матрицах, которые сегодня обычно состоят из агарозы или полиакриламида.

В последующие десятилетия были внесены усовершенствования в обнаружение белков/ДНК/РНК в гелях, типы используемых аппаратов (переход к погружению большого геля с несколькими образцами в водный раствор вместо гелей с одной пробой), разработка специализированных видов агарозы и внедрение капиллярного геля и импульсно-полевого гель-электрофореза (Roberts and Dryden 2013; Stellwagen 2009). В настоящее время гель-электрофорез является одним из наиболее распространенных инструментов анализа биомолекул в различных дисциплинах.

Подвижность молекулы в электрофорезе подчиняется теории: подвижность прямо пропорциональна приложенному напряжению (при этом фактическое пройденное расстояние увеличивается со временем) и чистому заряду на молекуле, и обратно пропорциональна трению молекулы (обычно определяемому ее массой и формой). Для небольших ионных биомолекул, таких как нуклеотиды или аминокислоты, ожидаемое разделение можно предсказать, зная только заряд на единицу массы. Для более крупных молекул форма будет играть большую роль (Switzer and Garrity 1999).

Только уникальные характеристики гель-электрофореза позволяют эффективно анализировать ДНК и РНК. Для этих молекул заряд на единицу массы примерно одинаков при любом размере (отрицательный заряд, вносимый каждой фосфатной группой в каждом нуклеотиде, имеет одинаковый вклад). Таким образом, в свободном растворе подвижность ДНК не зависит от молекулярной массы, что делает этот метод бесполезным (хотя это выходит за рамки данной статьи, технически это справедливо только для ДНК размером более 400 пар оснований; см. Stellwagen 2009).

Только при введении полутвердой поддерживающей матрицы, такой как гель, происходит процесс, известный как молекулярное просеивание. В такой матрице трение молекулы становится определяющим фактором ее подвижности. Размер (длина) и форма нуклеиновой кислоты определяют ее продвижение через гель (Switzer and Garrity 1999).

Разработанная теория, названная моделью «смещенной рептилии», описывает движение молекулы ДНК через гель, названный так потому, что она движется примерно так же, как змея (Roberts and Dryden 2013; Viovy 2000). Подвижность обратно пропорциональна логарифму длины; чем длиннее нить ДНК, тем сильнее она сопротивляется движению через гель. Соответственно, большинство экспериментов по электрофорезу проводятся параллельно со стандартом размера - раствором молекул известного размера, с которым можно сравнить неизвестный фрагмент.

На практике на скорость миграции нуклеиновой кислоты или белка при электрофорезе влияют и другие факторы. Наиболее значимым из них является размер пор геля. Эффективный размер пор уменьшается с увеличением концентрации, ограничивая движение все более крупных молекул. Полиакриламидные гели (полиакриламидный гель-электрофорез (ПААГ)) образуют меньшие поры, чем агарозные гели, и поэтому более идеальны для разделения белков и небольших фрагментов ДНК (<500 bp).

Эффективный размер молекул ДНК в агарозных гелях составляет от 100 п.н. до 50 кб.н. При размере более 50 кб.н. все молекулы мигрируют примерно с одинаковой скоростью; при размере более 2 миллионов пар оснований нуклеиновая кислота не проникает в гель. Для облегчения разделения ДНК в диапазоне от 50 до 10 000 кбп была разработана методика импульсно-полевого гель-электрофореза (PFGE) (Roberts and Dryden 2013). Еще одним фактором является напряжение. Как и ожидалось, при большем напряжении молекулы будут мигрировать быстрее. Однако при слишком высоком напряжении выделяемое тепло разрушает матрицу геля, что приводит к неожиданной диффузии/размазыванию анализируемых молекул.

Последовательности и конформации молекул также играют роль в их разделении. Это особенно верно, когда белки разделяются в их нативном состоянии (нативный PAGE). Эти сложенные белки не только имеют уникальную форму и посттрансляционные модификации, но и их заряд на единицу массы зависит от последовательности аминокислот. Разделение белков больше всего похоже на разделение ДНК, когда проводится SDS-PAGE (додецилсульфат натрия-полиакриламидный гель-электрофорез). При этом комбинация тиола и детергента (SDS) денатурирует белок, который затем помещается в полиакриламидный гель, насыщенный SDS. Отрицательно заряженный детергент покрывает белок из расчета примерно одна молекула на две аминокислоты, что делает эффективный заряд на единицу массы одинаковым для всех анализируемых белков.

Последовательности и конформации ДНК также могут иметь значение; свернутые, зазубренные или линейные ДНК мигрируют с разной скоростью при одинаковой длине. Определенные последовательности также приводят к искривлению ДНК, которая, по-видимому, мигрирует в полиакриламидных гелях медленнее, чем в агарозных (Roberts and Dryden 2013; Switzer and Garrity 1999; Stellwagen 2009). Однако в целом гель-электрофорез является надежным и простым способом определения длины фрагмента ДНК или денатурированного белка.