Нормально развитые морула (3) и бластоциста (4)

Яйцеклетки для культивирования in vitro получают из яичников коров, убитых на мясокомбинате, методом рассечения фолликулов в среде Хенкса с добавлением 1% фетальной сыворотки, 1 ед/мл гепарина и 5 мкг/мл гентамицина. Используют морфологический, цитологический и цитогенетический методы оценки их качества.

Нормально развитые эмбрионы имеют неповрежденные, равномерные по ширине, опалесцирующие оболочки и бластомеры в состоянии дробления, соответствующие возрасту эмбриона. К 5 -7-му дню развития они обычно достигают стадии морулы (рис 5.5.;3).

Прозрачная зона нормальных морул имеет форму сферы. Удваивание числа бластомеров в морулах происходит через каждые 24 часа. Различия в степени дробления эмбрионов в ранний период их развития могут быть обусловлены растянутостью сроков овуляции. Бластомеры морул не обязательно должны иметь одинаковую величину, что зависит от возможной асинхронности процесса их деления. На 7-8-й день после осеменения коров-доноров в промывной жидкости обнаруживаются бластоцисты.

Нормальная ранняя бластоциста (рис. 5.5;4) имеет толщину прозрачной оболочки, примерно, 12 мкм, число бластомеров может быть от 80 до 120, просматривается небольшая полость бластоцисты. Поверхность клеточной массы – гладкая, равномерная, что указывает на наличие соединительного комплекса между клетками трофобласта, перивителлиновое пространство маленькое.

Морфологически нормальная поздняя бластоциста на стадии экспандирования – выхода из прозрачной оболочки (8,5 дней после осеменения) характеризуется следующими показателями: прозрачная оболочка утончена, растянута, имеет форму правильной сферы; полость бластоцисты большая; перивителлиновое пространство отсутствует (.

На 9-й день развития прозрачная оболочка бластоцисты отсутствует, бластополость сохранена, клетки четко выражены (рис. 5.6;1).

Условно пригодными к пересадке можно считать эмбрионы с небольшими морфологическими изменениями (рис. 5.6.2):

1. С невыраженной неравномерностью дробления бластомеров.

2. Небольшим их сжатием.

3. С включениями в перивителлиновом пространстве.

4. С нарушениями прозрачной оболочки.

1 2 3 4

Рис. 5. 6. Стадии развития и качество эмбрионов

Ооциты яичников, выбракованных высокопродуктивных коров могут быть резервомполучения эмбрионов для трансплантации. Для этого необходимо добиться их созревания в специальной среде до стадии метафазы II, когда они окажутся способными к оплодотворению in vitro. Ооциты, выделенные из поверхностных фолликулов разного размера и из яичников коров в охоте окружены слоем фолликулярных клеток (рис. 5.6; 3).

Овоплазма морфологически нормальных ооцитов – это гранулированная масса, равномерно заполняющая пространство, ограниченное оболочкой. Нормальная оболочка ооцитов коров имеет форму равномерного по ширине прозрачного ободка. К числу морфологических нарушений оболочки ооцитов следует отнести потерю прозрачности, деформацию, истончение или утолщение, надрыв ее или разрыв (рис. 5. 6; 4).

После оценки жизнеспособности ооцит – кумулюсные комплексы помещают в модифицированную среду ТС – 199 (Sigma), содержащую 5% эстральной сыворотки коров, и ставят на культивирование в СО₂ – инкубатор при температуре 38^оС; 5% СО₂ и 98% - ной влажности. Через 24 часа проводят оплодотворение. Капацитацию заморожено – оттаянной спермы осуществляют в модифицированном растворе Тироде (Sigma) с концентрацией гепарина 50 мкг/мл. Совместное культивирование яйцеклеток и спермиев осуществляют в течение 18 часов. После оплодотворения зиготы помещают в среду для культивирования ранних эмбрионов, представляющую собой модификацию среды ТС – 199 (Sigma), на монослой клеток кумулиса и инкубируют в течение 7-11 дней. Полученные эмбрионы пересаживают реципиентам. В 1999 году в лаборатории генетики РУП «НПЦ НАН Беларуси по животноводству» получены первые в республике телята из пробирки (in vitro).