DB1 EmbryoFreeze в сосуд Дьюара

Методика размораживания эмбрионов:

1. Достают пайеты из сосуда Дьюара, выдерживают на воздухе 10 секунд при комнатной температуре и погружают на 10 секунд в водяную баню (оттаиватель) при температуре 25°С.

2. Содержимое пайет вместе с эмбрионом переносят на часовое стекло и делают последовательную проводку (перемещение) по нисходящей концентрации растворов, либо удаляют криопротектор одноступенчато (табл. 5.5).

3. После морфологической оценки качества эмбрионов их заправляют в пайеты вышеуказанным способом.

4. Пайету вставляют в металлический цилиндр катетера.

5. Одевают вначале защитный чехол, затем поверх него полиэтиленовый санитарный чехол. На нем указывают номер закрепленного животного-реципиента, которому и пересаживают зародыш.

6. Для пересадки эмбрионов используют животных-реципиентов не имеющих генетической ценности.

Таблица 5.5. Методика удаления криопротекторов из эмбрионов

Методика охлаждения эмбрионов в замораживателе.

1. Подача жидкого азота обеспечивается действием электронного клапанного устройства 4 (рис. 5.3) и производится в направлении из сосуда Дьюара (3) в морозильную камеру снизу (1).

2. Сигналы с датчика температуры (2), размещенном внутри электронного блока автоматики, обуславливают подачу ответного сигнала на клапан (4), регулируя тем самым скорость охлаждения.

3. После окончания программы замораживания пайеты, фиксируя пинцетом за пластиковые пробки, быстро переносят из морозильной камеры программного замораживателя в стандартную канистру с жидким азотом сосуда Дьюара (рис. 5. 4).

Микроскопическая оценка качества. В технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота оценке биологической полноценности зародышей придается большое значение.Оценивают их качество на основании определения стадии развития, состояния оболочек и внутренних структур. Биологически полноценными принято считать эмбрионы, которые имеют:

1. Правильную шарообразную форму;

2. Гомогенную светлую цитоплазму;

3. Неповрежденную прозрачную оболочку;

4. Одинакового размера бластомеры с плотным межклеточным контактом.

5. Они должны соответствовать по уровню дробления возрасту от момента оплодотворения до их извлечения.

При оценке эмбрионов соблюдают следующую последовательность:

1. После процедуры промывания рогов матки коровы-донора мерные бутыли с полученной жидкостью передают через окно-шлюз в стерильный бокс.

2. Осаждение эмбрионов производят в течение 20 минут в термостате при 37°С.

3. Верхнюю часть жидкости из каждой емкости удаляют с помощью сифона, оставляя 50-100 мл.

4. Отстой переносят в 2-3 пластмассовые чашки Петри, дно которых для удобства подсчета эмбрионов расчерчено на квадраты 0,8х0,8 см.

5. Под микроскопом при 15-20-и кратном увеличении находят эмбрионы и шприцем емкостью на 1 см³ (через присоединенную к нему укороченную пайету) переносят на малое часовое стекло в 1 мл солевого раствора Дюльбекко для кратковременного хранения и морфологической оценки при увеличении в 100 раз.

Выявляют неоплодотворенные яйцеклетки, без признаков развития и с дегенеративными изменениями оболочки или цитоплазмы (рис. 5. 5; 1).

Дегенерированные яйцеклетки имеют: сморщенную, неправильной формы цитоплазму. Нередко наблюдается разрушение цитоплазмы; растягивание, разрыв или расслоение прозрачной оболочки (рис. 5.5;2)..

1 2 3 4

Рис. 5. 5. Неоплодотворенная (1) и дегенерированная (2) яйцеклетки,