Понятие культуры изолированных клеток и тканей

Процесс выращивания клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) называется методом получения культуры изолированных тканей. Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями (рис. 3.1. и 3.2).

Культуры изолированных клеток и тканей.

Каллусные   Рис. 3.1. Каллусная ткань, выращенная из одной клетки на питательной среде	Опухолевые   Рис. 3.2.Патологическое разрастание качественно изменившихся растительных клеток
Каллусная ткань образуется в результате повреждения на целых растениях. Её также можно вырастить в стерильной культуре на питательной среде. Возникновение каллуса связано с неорганизованным делением (пролиферацией) дифференцированных клеток.	Растительные опухоли имеют бактериальное или вирусное происхождение. Превращение растительных клеток в опухолевые связано с проникновением в них ДНК бактериальной клетки, так называемой Ti-плазмиды, которая значительно изменяет свойства клетки.

Использование культуры изолированных клеток и тканей.

Культуры изолированных тканей широко используются в сельском хозяйстве и промышленном производстве. Они обладают преимуществами по сравнению с традиционным растительным сырьем (дикорастущими и выращиваемыми на плантациях растениями), а именно:

1. Независимостью от внешних условий.

2. Оптимизацией условий выращивания.

3. Автоматизацией и компьютеризацией процессов.

4. Возможностью выращивать исчезающие виды растений.

5. Возможностью массового клонального микроразмножения плодоовощных и декоративных растений.

6. Оздоровлением от вирусных и других инфекций.

7. Возможностью, с помощью культуры in vitro, расширения направлений селекционной работы, то есть - получить клоны клеток, затем и растения с запрограммированными свойствами.

Благодаря способности клеток синтезировать в культуре вторичные метаболиты, возникла новая отрасль промышленности, осуществляющая биологический синтез веществ, необходимых человеку.

Условия культивирования тканей и клеток.

Культивирование фрагментов ткани или одного растения - эксплантов, а тем более отдельных клеток, требует соблюдения полной асептики.

Микроорганизмы, которые могут попасть в питательную среду, выделяют токсины, тормозящие рост клеток и приводящие культуру к гибели. Поэтому все манипуляции с клетками и тканями при культивировании in vitro проводят с соблюдением определенных правил асептики в ламинар-боксе или в асептических комнатах. Асептика достигается подачей пропущенного через фильтры стерильного воздуха, направленного из ламинар-бокса наружу. На поверхности растительных тканей всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация, которая достигается путем обработки участков растений, из которых будут выделять экспланты, дезинфицирующими веществами (перекись водорода, сулема).

Для работы с биологическим материалом необходимы следующие составляющие:

- чистая посуда и биореактор (ферментёр);

- стерильная питательная среда;

- оптимальное освещение;

- оптимальная температура;

- оптимальная влажность;

- аэрация.

Чистая посуда и ферментёр. Предварительно завернутые в бумагу или фольгу инструменты и вату стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160^оС в течение 1,5-2 часов.

При использовании разных типов ферментеров было установлено, что физиологические свойства культур могут меняться, поэтому синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре следует проводить при подаче воздуха снизу. В этих условиях синтез протекает намного активнее (рис. 3.3).

При выращивании клеток в малых объемах, например, в колбах, нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии.

Питательные среды. Культивирование изолированных клеток и тканей происходит в многокомпонентных питательных средах. Они могут существенно различаться по своему составу, однако в состав всех сред обязательно входит и компонентная основа, к которой добавляют необходимые растениям группы веществ: макро- и микроэлементы, углеводы, витамины и фитогормоны. Такой компонентной основой служит агар-агар – полисахарид морских водорослей, способный образовывать в воде гели, затвердевающие при 45°С. В питательную среду могут быть добавлены эндоспермы незрелых зародышей (кокосового ореха, конского каштана), патока некоторых деревьев, различные экстракты (солодовый, дрожжевой), томатный сок. Введение их в среду дает положительный результат. Однако каждый действующий компонент имеет свойственные только ему технологические характеристики.

Рис. 3.3. Биореактор (ферментер) для выращивания микроорганизмов, клеток или тканей

Дедифференцировка – основа процесса образования каллуса.

Дедифференцировка– это возвращение специализированных клетокв меристематическое состояние, когда они получают способность к делению.

Органы и ткани растений служат исходным материалом для получения культур клеток и тканей, однако, чаще для этого используют листья растений.

Предварительно отработанный стерильный фрагмент листа помещают на твердую питательную среду. Листья состоят из разных тканей, клетки которых дифференцированы и синтезируют различные, характерные для этих клеток молекулы белков, углеводов, липидов и др. веществ. Данные дифференцированные клетки не обладают способностью к делению.

В процессе механическом повреждении листа происходит выделения экспланта, а под действием добавленных в среду растительных гормонов ауксинов и цитокининов клетка дедифференцируется. Она теряет запасные вещества – крахмал, белки, липиды, специализированные органеллы хлоропласты и др. В результате этого все клетки приобретают новые близкие морфологические и физиологические свойства, т.е. становятся каллусными (делящимися) клетками. На листовом экспланте формируется каллусная ткань.

Типы клеточных культур. В зависимости от способа и условий культивирования существуют несколько типов культур клеток и тканей:

- каллусная культура;

- суспензионная культура;

- культура одиночных клеток.

Если культивирование происходит поверхностно на агаризованной питательной среде, то образуется каллусная ткань. Она не имеет четкой структуры, но может различаться по плотности. Происхождение и условия выращивания определяют, будет ли каллусная ткань рыхлой, средней плотности или плотной.

Общие характеристики каллусных клеток. Каллусная клетка обладает целым рядом свойств, общих со всеми растительными клетками. Это онтогенез клеток, устойчивость к тем или иным неблагоприятным факторам внешней среды и другие свойства. Вместе с тем, у каллусных клеток во время их культивирования появляются свои индивидуальные особенности, такие как физиологическая асинхронность, генетическая гетерогенность и некоторые другие.

Физиологическая асинхронность заключается в том, что в каждый момент времени клетки находятся в разных фазах роста: одни делятся, другие растут, а третьи уже стареют. Поэтому общее физиологическое старение всей популяции каллусных клеток принято оценивать по состоянию большинства клеток (рис. 3.4).

Рис. 3.4. Каллусные клетки вРис. 3.5. Выход протопласта через