Количественное определение углеводов

Сущность метода заключается в окислительно-восстановительной реакции между пикриновой кислотой и альдегидной группой углеводов в щелочной среде с образовани­ем пикраминовой кислоты с оранжево-красной окраской и глюконовой кислоты. Это можно выразить следующей схемой:

Интенсивность окраски зависит от количества восстанавливающих веществ (углеводов), на основании чего методом фотозлектроколориметрии или визуального сравнения со стандартной шкалой определяют содержание углеводов.

Оборудование: водяная баня автоматическая – 1 шт., стеклянная воронка (для фильтрования) – 1 шт., весы – 1 шт., мерные цилиндр на 50 мл – 1 шт., мерные колбы на 100 мл – 2 шт., мерные пипетки на 1 мл, 5 мл, 10 мл – по 1 шт., бумажные фильтры «белая лента», химический стакан на 100-150 мл – 2 шт., ножницы – 1 шт., фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектрофотометр (зелёный светофильтр (455 нм) – 1 шт., фарфоровая ступка с пестиком – 1 шт.

Реактивы: свежий растительный материал (морковь, картофель, капустный лист, груша или др.), 20%-ный раствор гидроксида натрия, раствор глюкозы, насыщенный раствор пикриновой кислоты, песок кварцевый (для измельчения растительного материала).

Ход работы.Берут навеску растительного материал (например, красной моркови, m = 1 г), растирают в ступке с кварцевым песком до однородной массы, количественно переносят в мерную колбу на 100 мл, приливают приблизительно 50 мл воды.

Для наиболее полного выделения углеводов мерную колбу с содержимым нагревают на водяной бане при t = 60^оC 15 минут, охлаждают до комнатной температуры и доводят до метки дистиллированной водой. Содержимое колбы фильтруют через сухой складчатый фильтр.

К 2 мл фильтрата, содержащего 0,2-3мг восстанавливающих сахаров, приливают 2,5 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты, добавляют 0,3 мл 20% раствора NaOH и доводят до определенного обьема водой (например, до 10 мл). Содержимое пробирки тщательно перемешивают и ставят на 10 минут в кипящую баню.

Одновременно готовят стандартную шкалу, для чего берут навеску глюкозы (100 мг). Растворяют в мерной колбе на 100 мл. В пять пробирок наливают соответственно по 1, 2, 3, 4, 5 мл раствора глюкозы, также добавляют все вышеуказанные реактивы, дово­дят водой до 10 мл и нагревают 10 минут на кипящей водяной бане. Сначала строят график калибровочной кривой но данным экстинций стандартных растворов и соответствующих концентраций глюкозы. (D = - lg (T/100)).

Фотометруют при зеленом светофильтре (455 нм). Чувствительность метода – меньше 50 мкг глюкозы в 1 мл.

Расчёт. Пусть из навеки моркови в 1 г все растворимые сахара экстрагировались в 100 мл воды. Взято для определения сахаров 2 мг. Интенсивность окраски совпала с окраской содер­жимого пробирки №2 стандартной шкалы, где количество сахара (глюкозы) составляет 2 мг. Следовательно, 2 мг находятся и в двух миллилитрах экстракта, что соответствует 1 г сырой моркови. Значит, в 100 г моркови будет содержаться 10 г сахара.