Определение активности амилазы слюны по методу Вольгемута

Оборудование: вата, водяная баня автоматическая, пластиковые одноразовые стаканы (для слюны) – 1 шт., стеклянная воронка (для фильтрования) – 1 шт., пипетки для отбора проб (глазные пипетки) – 1 шт., водяная баня автоматическая – 1 шт., мерные пипетки на 1 мл, мерные цилиндры на 10 мл и 20 мл – по 1 шт.

Реактивы: раствор иода (раствор I₂ в KI), 0,1% раствор крахмала, 10%-ные растворы соляной кислоты и гидроксида натрия, 3% раствор сульфата меди (II), 1% раствор хлорида натрия, раствор разбавленной слюны, 1%-ый раствор сахарозы.

Ход работы.1. Подготовка пробы слюны.

1. Способ приготовления разбавленной слюны. Рот ополаскивают 2-3 раза водой. Собирают слюну, не разбавленную водой.

2. Собранную слюну разбавляют в 10 раз.

2. Проведение исследования по методу Вольгемута.

1. В 10 пробирок наливают по 1 мл воды.

2. В пробирку №1 приливают 1 мл разведённой в 10 раз слюны, перемешивают (разбавление полученной слюны = 0).

3. Отливают 1 мл разбавленного раствора из пробирки №1 в пробирку №2, перемешивают (разбавление = 40).

4. Подобные действия продолжают до пробирки №10.

5. Из пробирки №10 1 мл раствора слюны выливают. Таким образом, получается ряд разведенной слюны, в котором в каждой последующей пробирки содержание фермента вдвое меньше, чем в предыдущей (20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280, 2560, 5120, 10240).

6. Во все пробирки добавляют по 1 мл воды и по 2 мл 0,1% раствора крахмала, содержимое пробирок перемешивают, встряхиванием, и помещают в термостат при t = 38 °С на 30 минут.

7. После инкубации пробирки охлаждают в воде со льдом.

8. В каждую пробирку добавляют по 1-2 капли 0,1% раствора йода и перемешивают.

Результаты эксперимента количественного определения ферментативной активности амилазы представьте в форме таблицы 4.

Таблица 4. Ферментативная активность слюны в оптимальных условиях

Наблюдается разная степень гидролиза крахмала, зависящая от количества фермента – α-амилазы, которая катализирует реакцию:

(С₆Н₁₀О₅)_n + nH₂O → декстрины → С₁₂Н₂₂О_11.

крахмал мальтоза

3. Вычисление активности α-амилазы слюны в оптимальных условиях её работы.

Пример расчёта активности фермента

в условиных единицах

Последняя пробирка с жёлтой окраской раствора – №3, в которой произошёл полный гидролиз крахмала при максимальном разведении слюны в 80 раз. 1 мл слюны, разведенной в 80 раз, содержит 1/80 мл неразведенной слюны. 1/80 мл неразведённой слюны гидролизует 2 мл 0,1% раствора крахмала, а 1 мл неразведённой слюны – х мл 0,1%раствора крахмала: 1/80 : 1 = 2:х; х= 1·2: 1/80 ; х= 160 единиц.