ПРИГОТОВЛЕНИЕ, ФИКСАЦИЯ И ОКРАСКА МАЗКОВ КРОВИ. ВЫВЕДЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТАРНОЙ ФОРМУЛЫ

Материал и оборудование; смесь 96° этилового спирта и эфира 1:1, фабричный раствор краски Романовского, иммерсионное масло, бензин, вата для протирания мазков и объективов микроскопов, микроскопы с крестоподвижными столиками или препаратоводителями, приборы для массовой окраски мазков крови, хорошо обезжиренные предметные стекла, шлифованные предметные стекла, чашки Петри со спичками, мерные цилиндры на 20-50 мл, стаканчики с дистиллированной водой.

Техника приготовления мазков. Используют хорошо подготовленные предметные стекла. Вначале их промывают водопроводной водой, а затем дистиллированной, протирают полотенцем и помещают для обезжиривания в банку с притертой крышкой на 24 ч в смесь (1:1) 96° этилового спирта с эфиром. Перед работой стекла извлекают пинцетом и протирают полотенцем.

Лучше мазки готовить из свежей крови, хуже - из стабилизированной. Предметное стекло берут за торцовые части большим и указательным пальцами левой руки, на краю стекла вблизи от указательного пальца наносят небольшую каплю крови (диаметром около 3 мм), взятой из пробирки с помощью глазной или пастеровской пипетки или краем резиновой пробки. Затем, удерживая большим и указательным пальцами правой руки под углом 30-45°, шлифованное стекло подводят к капле крови и равномерно распределяют кровь по краю стекла. После этого плавно и не очень быстро продвигают шлифованное стекло по предметному стеклу в сторону большого пальца. Приготовленный мазок высушивают на воздухе. Хороший мазок должен быть ровным, тонким, занимать ^s/^ длины стекла, иметь с боков свободные поля шириной около 1 см. В средней части мазка пишут (углом другого стекла, иглой или простым карандашом) дату изготовления и номер животного.

Фиксация мазков. В течение 2 дней после изготовления мазки необходимо зафиксировать или окрасить. Для фиксации применяют метиловый спирт (5 мин), этиловый спирт (30 мин), смесь этилового спирта и эфира 1 : 1 (30 мин).

Окраска мазков по Романовскому - Гимзе. Фиксированный препарат кладут мазком вниз на две спички (без головок) в чашку Петри и под препарат подливают рабочий раствор краски (к 1 мл дистиллированной воды прибавляют 2 капли фабричного раствора краски Романовского). Для приготовления раствора краски используют нейтральную дистиллированную воду. Окрашивание. продолжается 25-40 мин, что зависит от температуры окружающего воздуха и качества краски. Окрашенный мазок промывают дистиллированной водой и сушат на воздухе.

Окрашенные мазки крови исследуют под микроскопом с использованием иммерсионной системы (объектив 90) и иммерсионного масла. После исследования масло удаляют с препарата ватой, пропитанной бензином, керосином, бензолом. В окрашенных мазках определяют морфологию клеток, а также устанавливают их соотношение между отдельными видами.

Морфология эритроцитов. У млекопитающих животных эритроциты круглой (двояковыпуклой) формы (лишь у верблюдов и лам они овальные) и не содержат ядер, у птиц они овальной формы и с ядрами. Эритроциты окрашены в розовый цвет, причем в центральной части более бледно.

Морфология тромбоцитов. Это самые маленькие клетки крови (их диаметр 1-4 мкм), обычно лежат группами (по 5-6 и более), угловатой, овальной или округлой формы; цитоплазма окрашена в голубой цвет, а гранулы - в фиолетовый или красно-фиолетовый. У птиц тромбоциты содержат ядра.

Морфология лейкоцитов. Базофилы (Б) имеют круглую форму, ядро полиморфное, плохо заметное, окрашено в фиолетовый цвет; цитоплазма розового или бледно-фиолетового цвета; гранулы круглой или расплывчатой формы, окрашены в темно-фиолетовый или темно-синий цвет, они часто разрушены.

Эозинофилы (Э) круглой формы; цитоплазма слабо голубая, содержит розово-красную крупную зернистость; ядро фиолетового цвета, чаще состоит из 2-3 сегментов.

Нейтрофилы (Н) имеют круглую форму; цитоплазма окрашена в слабо-розовый цвет и содержит мелкую, розового цвета зернистость, которая часто плохо видна. Ядро темно-фиолетового цвета. По степени зрелости, что характеризуется формой ядра, различают миелоциты (М) с круглым или овальным ядром фиолетового цвета (у здоровых животных в крови не встречаются) и юные (Ю) - с бобовидным или колбасовидным ядром (у взрослых животных регистрируются редко); палочкоядерные нейтрофилы имеют вытянутое ядро с булавовидньми вздутиями на концах, которое может быть изогнуто в виде подковы, латинской буквы S, окрашено в темно-фиолетовый цвет, являются зрелыми клетками и постоянно встречаются в крови у здоровых животных; сегментоядерные (С) нейтрофилы - с ядром, состоящим из нескольких (2-5) сегментов, соединенных тонкими перемычками, количество этих клеток у разных видов животных колеблется в широких пределах.

Таблица 2 Физиологические показатели крови по А.А. Кудрявцеву

Лимфоциты (Л) круглой формы клетки с круглым ядром темно-фиолетового цвета; цитоплазма слабо-голубого цвета, имеет вокруг ядра зону просветления (перинуклеарную зону), иногда в цитоплазме содержится несколько зерен красного цвета; различают малые (их больше всего), средние и большие лимфоциты, что связано в основном с количеством цитоплазмы.

Моноциты (М) круглой или нередко неправильной формы, ядро чаще фигурное в виде подковы, бабочки, трилистника, бобовидное, но может быть сильно лопастным, окрашивается неравномерно в фиолетовый цвет с темно-фиолетовыми участками; цитоплазма серо-дымчатая или серовато-голубоватая, содержит мелкую пылевидную зернистость.

Клетки Тюрка (КТ), или плазмоциты, похожи на лимфоциты, но имеют темно-синюю цитоплазму, содержащую многочисленные вакуоли; в норме встречаются редко.

Выведение лейкоцитарной формулы. Лейкоцитарная формула (лейкограмма) - это процентное соотношение между отдельными формами лейкоцитов крови. Выводят ее или по методу Шиллинга, или по способу Филиппченко. Метод Шиллинга (четырехпольный метод меандра) используют при исследовании крови животных с преобладанием в ней нейтрофильных лейкоцитов (лошади, собаки, ослы, мулы, верблюды, пушные звери и т. д.). На мазок наносят четыре капли иммерсионного масла (по краям с одной и другой сторон в начале и конце мазка) и в каждом участке подсчитывают по 25 лейкоцитов, регистрируя каждый вид лейкоцитов отдельно на 11-клавишном счетчике клеток. При этом от края мазка просматривают 4 поля зрения, затем перемещаются на несколько полей вдоль мазка, после чего возвращаются к краю мазка. Набрав 25 лейкоцитов на первом участке мазка, перемещают объектив на второй, третий и, наконец, четвертый участок. Таким образом, всего будет подсчитано 100 лейкоцитов.

Рис.18 Кровь крупного рогатого скота

1-4 Базофилы: 1- моноцит, 2 – юный, 3-4 – сегментоядерные; 5-16 Эозинофилы:5-6 –миелоциты, 7-8 – юные, 9-12 - палочкоядерные; в 12-патологически измененное ядро, 13-15 – сегментоядерные, 16 раздавленный эозинофил с «тенью ядра» выпавшим из цитоплазны зернами

Метод Филиппченко (трехпольный метод) применяют при исследовании крови, в которой наибольший процент лейкоцитов составляют лимфоциты, что наблюдается у крупного и мелкого рогатого скота. По этому методу мазок исследуют поперек в трех участках: в начале, середине и конце его. На мазок с одного края наносят 3 капли иммерсионного масла и просматривают препарат от одного края до другого, подсчитывая в каждой зоне 35, 30 и 35 лейкоцитов, при этом общая сумма клеток составит 100 лейкоцитов.

Лейкограммы крови животных представлены в таблице2.

В настоящее время для проведения гематологических исследований кров используют анализаторы

В геманализаторе используется методика проточной цитометрии – клетки, выстраиваясь одна за другой, проходят через очень узкие капилляры, где их считают и изменяют при помощи лазера.

Геманализатор способен определить наличие или отсутствие гранул в лейкоцитах, размеры этих гранул, наличие включений в эритроцитах. За несколько милисекунд анализатор выполняет сложные расчеты эритроцитарных, лейкоцитарных и тромбоцитарных индексов.

Некоторые неполноценные клетки могут определяться неправильно – обломки эритроцитов, незрелые и лейкемические клетки. Поэтому после исследования крови на геманализаторе мазок крови просматривает врач под микроскопом – «мануальная дифференциация».

1)Гематокрит (Ht, HCT) соотношение объёмов эритроцитов и плазмы (объемная фракция эритроцитов в крови
Повышение

* Первичные и вторичные эритроцитозы (повышение кол-ва эритроцитов);
* Дегидратации (заболевания ЖКТ, сопровождающиеся профузным поносом, рвотой; диабет);
* Уменьшение объема циркулирующей плазмы (перитонит, ожоговая болезнь).
Снижение

* Анемии;
* Повышение объема циркулирующей плазмы (сердечная и почечная недостаточность, гиперпротеинемии);
* Хронический воспалительный процесс, травмы, голодание, хроническая гиперазотемия, онкологические заболевания;
* Гемодилюция (внутривенное введение жидкостей, особенно при сниженной функциональной способности почек).

2)Эритроциты (RBC) безъядерные форменные элементы крови, содержащие гемоглобин. Составляют основную массу форменных элементов крови
Повышение

* Эритремия – абсолютный первичный эритроцитоз (усиление выработки эритроцитов);
* Реактивные эритроцитозы, вызванные гипоксией (вентиляционная недостаточность при бронхолегочной патологии, пороки сердца);
* Вторичные эритроцитозы, вызванные повышением продукции эритропоэтинов (гидронефроз и поликистоз почек, новообразования почек и печени);
* Относительные эритроцитозы при дегидратации.
Снижение

* Анемии (железодефицитная, гемолитическая, гипопластическая, В12-дефицитная);
* Острая кровопотеря;
* Поздние сроки беременности;
* Хронический воспалительный процесс;
* Гипергидратация.

Цветовой показатель – характеризует среднее содержание гемоглобина в одном эритроците. Отражает усреднённую интенсивность окраски эритроцитов. Используется для деления анемии на гипохромные, нормохромные и гиперхромные.

3)Средний объем эритроцита (MCV) показатель, используемый для характеристики типа анемии
Повышение

* Макроцитарные и мегалобластические анемии (В12-фолиеводефицитная);
* Анемии, могущие сопровождаться макроцитозом (гемолитическая).

Норма

* Нормоцитарные анемии (апластическая, гемолитическая, кровопотери, гемоглобинопатии);
* Анемии, могущие сопровождаться нормоцитозом (регенераторная фаза железодефицитной анемии, миелодиспластические синдромы.
Снижение

* Микроцитарные анемии (железодефицитная, сидеробластическая, талассемия);
* Анемии, могущие сопровождаться микроцитозом (гемолитическая, гемоглобинопатии).

4)Показатель аницитоза эритроцитов (RDW) состояние, при котором одновременно обнаруживаются эритроциты различной величины (нормоциты, микроциты, макроциты)
Повышение

* Макроцитарные анемии;
* Миелодиспластические синдромы;
* Метастазы новообразований в костный мозг;
* Железодефицитные анемии.

Снижение

* Информация отсутствует.

5)Ретикулоциты незрелые эритроциты, содержащие остатки РНК в рибосомах. Циркулируют в крови в течение 2-х дней, после чего, по мере уменьшения РНК, превращаются в зрелые эритроциты
Повышение

* Стимуляция эритропоэза (кровопотеря, гемолиз, острый недостаток кислорода).
Снижение

* Угнетение эритропоэза (апластические и гипопластические анемии, В12-фолиеводефицитная анемия).

6)Скорость (Реакция) оседания эритроцитов (СОЭ, РОЭ, ESR) неспецифический показатель диспротеинемии, сопровождающей процесс болезни
Повышение (ускорено)

* · Любые воспалительные процессы и инфекции, сопровождающиеся накоплением в крови фибриногена, a- и b- глобулинов;
* · Заболевания, сопровождающиеся распадом (некрозом) тканей (инфаркты, злокачественные новообразования, и т.д.);
* Интоксикации, отравления;
* Болезни обмена (сахарный диабет и пр.);
* Болезни почек, сопровождающиеся нефротическим синдромом (гиперальбуминемия);
* Заболевания паренхимы печени, ведущие к выраженной диспротеинемии;
* Беременность;
* Шок, травмы, оперативные вмешательства.
Наиболее значимые повышения СОЭ (более 50 - 80 мм/ч) наблюдаются при:

* парапротеинемические гемобластозы (миеломная болезнь);
* злокачественные новообразования;
* заболевания соединительной ткани и системные васкулиты.

Снижение - Гемолитическая анемия.

7)Тромбоциты
Повышение - Инфекции, воспаления, неоплазии.
Снижение - Уремия, токсемия, инфекции, гипоадренокортицизм, иммунные расстройства, кровотечения.

8)Гемоглобин (Hb, HGB) кровяной пигмент (сложный белок), содержащийся в эритроцитах, основная функция которого – перенос кислорода и углекислого газа, регуляция кислотно-основного состояния
Повышение

* Первичные и вторичные эритроцитозы;
* Относительный эритроцитоз при дегидратации.

Снижение

* Анемии (железодефицитная, гемолитическая, гипопластическая, В12-фолиеводефицитная);
* Острая кровопотеря (в первые сутки кровопотери из-за сгущения крови, обусловленного большой потерей жидкости, концентрация гемоглобина не соответствует картине истинной анемии);
* Скрытые кровотечения;
* Эндогенная интоксикация (злокачественные опухоли и их метастазы);
* Поражение костного мозга, почек и некоторых других органов;
* Гемодилюция (внутривенное введение жидкостей, ложная анемия).

9)Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (MCHC) показатель, определяющий насыщенность эритроцитов гемоглобином
Повышение

* Гиперхромные анемии (сфероцитоз, овалоцитоз).

Снижение

* Гипохромные анемии (железодефицитная, сферобластическая, талассемия).

10)Среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH) – редко используется для характеристик анемии
Повышение

* Гиперхромные анемии (мегалобластические, цирроз печени).

Снижение

* Гипохромные анемии (железодефицитная);
* Анемии при злокачественных опухолях.

Лейкоцитарная формула - процентное соотношение различных форм лейкоцитов в крови (в окрашенном мазке). Изменения лейкоцитарной формулы могут быть типичными для определенного заболевания.

1)Лейкоциты (WBC) клетки крови, основная функция которых заключается в защите организма от чуждых ему агентов
Повышение (лейкоцитоз)

* Бактериальные инфекции;
* Воспаление и некроз тканей;
* Интоксикация;
* Злокачественные новообразования;
* Лейкозы;
* Аллергии;
* Результат действия кортикостероидов, адреналина, гистамина, ацетилхолина, ядов насекомых, эндотоксинов, препаратов наперстянки.

Относительно длительное повышение числа лейкоцитов наблюдается у беременных и при длительном курсе кортикостероидов. Наиболее выраженный лейкоцитоз отмечается при:
* хронических, острых лейкозах;
* гнойных заболеваниях внутренних органов (пиометра, абсцессы и пр.)