ПОЛУЧЕНИЕ КРОВИ У ЖИВОТНЫХ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ОСЕДАНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ (СОЭ), КОЛИЧЕСТВА ГЕМОГЛОБИНА, ЭРИТРОЦИТОВ И ЛЕЙКОЦИТОВ В КРОВИ

Материал и оборудование{ исследуемое животное, 10 %-ный раствор трилоиа Б, раствор гепарина (в 1 мл раствора содержится 1 тыс. ЕД гепарина), натрия цитрат, натрия оксалат, спирт этиловый, спиртовой раствор йода, 3 %-ный раствор натрия хлорида, жидкость Тюрка (3 %-ный раствор уксусной кислоты 100 мл и 1 %-ный раствор метиленового синего 1 мл), вата, стаканчики с дистиллированной водой, эритроседиометры Неводова, аппараты Панченкова, гемометры ГС-3 (гемометры Сали), микроскопы, счетные камеры с сеткой Горяева (на каждого учащегося), шлифованные покровные стекла, иглы для взятия крови, резиновые жгуты, ножницы, стерилизатор, пробирки с резиновыми пробками, штативы, пастеровские пипетки, мерные пипетки на 1 и 5 мл, капилляры на 0,02 мл крови с резиновыми трубками.

Получение крови у животных. У крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, верблюдов, буйволов, яков, оленей ее берут из яремной вены посредством кровопускательных игл; у свиней - из крупных сосудов уха, краниальной полой вены или из хвоста (отрезают его кончик или пересекают на вентральной поверхности кровеносные сосуды); у собак - из вены сафены на тазовой конечности или подкожной вены предплечья на грудной конечности; у кроликов - из ушной вены; у пушных зверей - из лапки (пальца), кончика хвоста; у кур - из кровеносных сосудов на внутренней поверхности крыла, а в небольшом количестве - из гребня и сережек; у уток и гусей - из мякоти ступни конечностей; у мышей - из хвоста.

Предварительно на месте взятия крови выстригают или выбривают волосы, а кожу протирают ватным тампоном, смоченным спиртом или спиртом-эфиром. Для получения капиллярной крови кожу прокалывают обычной инъекционной иглой. Первую каплю крови удаляют ватным тампоном, а последующие капли используют для исследования.

Из яремной вены кровь берут на месте перехода верхней трети шеи в среднюю. Вначале пережимают вену пальцем левой руки, резиновым жгутом или другими приспособлениями, а затем при наступлении хорошо заметного наполнения кровью прокалывают ее кровопускательной иглой. Кровь собирают в пробирку. Для предупреждения ее свертывания используют такие антикоагулянты (из расчета на 10 мл крови) как 4 капли 10 %-ного рас» твора трилона Б, 1 каплю раствора гепарина, 30 мг цитрата натрия или 15 мг оксалата натрия.

Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ). В эритро-седиометр Неводова (градуированная пробирка со 100 делениями) вносят 30 мг цитрата натрия, с помощью кровопускательной иглы из яремной вены лошади набирают кровь до метки «О», пробирку закрывают резиновой пробкой и переворачивают 10-12 раз для смешивания антикоагулянта с кровью (эту часть методики выполняет лаборант перед занятием или учащийся во время взятия крови у животных). Эритроседиометр с кровью ставят вертикально в штатив и отмечают время начала исследования, а затем регистрируют уровень оседания эритроцитов (по высоте образующегося столбика плазмы) через каждые 15 мин в течение 1 ч и записывают показатели в тетрадь. Окончательный результат СОЭ определяют через 24 ч от начала ее постановки.

У здоровых лошадей СОЭ составляет: через 15 мин - 30-40, 30 мин - 52-56, 45 мин - 56-60, 60 мин - 62-65, 24 ч - 65-70. У других животных СОЭ протекает значительно медленнее: так, у крупного рогатого скота через 24 ч всего 1-2, у свиней- 25-40, у собак - 3-5.

Определение количества гемоглобина в крови гематиновьш методом (методом Сали). Принцип определения основан на реакции гемоглобина крови и соляной кислоты с образованием соляно-кислого гематина, имеющего бурую окраску. Интенсивность окраски исследуемой пробы крови добавлением дистиллированной воды уравнивают с цветом стандартов, после чего определяют содержание гемоглобина в граммах в 100 мл (г/100 мл) или в 1 л крови (г/л).

Техника определения. В градуированную пробирку гемометра ГС-3 до метки «2» вносят глазной пипеткой 0,1 н. (или 1 %-ный) раствор соляной кислоты. В капилляр набирают 0,02 мл стабилизированной крови, кончик капилляра вытирают ватой. Опускают капилляр в раствор соляной кислоты и выдувают кровь »а дно пробирки. Капилляр промывают раствором кислоты 2-3 раза для удаления остатков крови, не допуская образования пузырьков воздуха. Перемешивают содержимое пробирки вращением ее между ладонями до однородной массы. Ставят пробирку в штатив на 5 мин, в течение этого времени образуется соляно-кислый гематин с появлением бурой окраски жидкости. Далее в пробирку вносят по 3-5 капель раствора соляной кислоты (или дистиллированной воды), перемешивая содержимое вращательными движениями стеклянной палочки. Раствор кислоты добавляют до тех пор, пока окраска испытуемой пробы не сравняется с цветом стандартных пробирок. Количество гемоглобина в исследуемой пробе устанавливают по совпадению уровня жидкости с соответствующей черточкой градуированной шкалы пробирки и выражают в граммах гемоглобина s 100 мл крови (табл.1).

Таблица 1

Количество гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов в крови взрослых здоровых животных

Подсчет количества эритроцитов и лейкоцитов в крови. Техника подсчета эритроцитов. Перед исследованием кровь разбавляют в 200 раз, для чего в пробирку мерной пипеткой на 5 мл вносят 4 мл 3 %-ного раствора натрия хлорида. Затем из пробирки со стабилизированной кровью, которую предварительно хорошо смешивают, переворачивая пробирку 10-12 раз, берут капилляром от гемометра Сали 0,02 мл (20 мкл, 20 мм³) крови, ватой удаляют кровь с наружной поверхности капилляра. Опускают капилляр до дна пробирки и выдувают кровь в раствор натрия хлорида, промывая капилляр 2-3 раза верхним слоем жидкости для удаления остатков крови. Вращательными движениями пробирки между ладонями смешивают содержимое до получения однородной жидкости.

Готовят счетную камеру к работе, для чего на обе боковые грани камеры накладывают шлифованное покровное стекло. Притирают его большими пальцами обеих рук до появления радужных колец. Между покровным стеклом и средней гранью камеры (на которой имеются две сетки Горяева) образуется щель высотой 0,1мм, которую заполняют разведенной кровью. Для этого из пробирки в пастеровскую пипетку (или в капилляр от гемометра Сали) набирают разведенную кровь и осторожно одну каплю ее наносят на среднюю грань камеры перед краем покровного стекла. В силу капиллярности разведенная кровь заполняет пространство камеры.

Счетную камеру помещают на столик микроскопа, у которого опускают конденсор и направляют свет от плоского зеркала. Под микроскопом (при объективе 8 и окуляре 15) находят эритроциты и сетку Горяева. В поле зрения микроскопа устанавливают левый верхний большой квадрат сетки, разделенный на 16 маленьких квадратов, и подсчитывают эритроциты, начиная с верхнего ряда маленьких квадратов и переходя затем на следующие ряды их. Также ведут подсчет эритроцитов еще в 4 больших квадратах, разделенных на 16 маленьких квадратов и расположенных по диагонали сетки Горяева по диагонали от первого, т.е. от верхнего левого угла в правый нижний.

Расчет проводят по формуле

, где

X - количество эритроцитов в 1 мм³ крови в большом квадрате (в 1 мкл); А - количество эритроцитов, сетки Горяева. считанное в 5 больших квадратах; 200 - степень разведения крови; 80 - количество маленьких квадратов в 5 больших квадратах- 4000 - коэффициент для перечисления объема счетной камеры над одним маленьким квадратом в 1 мм³. Упрощенный вид формулы Х = А. 10 000

Количество эритроцитов в крови здоровых животных приведено в таблице 1.

Техника подсчета лейкоцитов. Кровь удобнее разводить в центрифужной пробирке с 0,4 мл жидкости Тюрка. Капилляром от гемометра Сали в нее вносят 0,02 мл крови. Для смешивания содержимого пробирку тщательно вращают между ладонями. Получают разведение крови 1/20. После этого ее набирают в пастеровскую пипетку и заряжают счетную камеру. Количество лейкоцитов подсчитывают в 100 больших (не разграфленных) квадратах сетки Горяева. Расчет проводят по формуле

, где

Х - количество лейкоцитов в 1 мм³ крови (в 1 мкл); А - количество лейкоцитов подсчитанное в 100 больших квадратах; 4000 - постоянный коэффициент для перечисления в 1 мм³ объема счетной камеры над одним маленьким квадратом;

20-степень разведения крови; 1600 - количество маленьких квадратов в 100 больших квадратах: Упрощенный вид формулы Х = А*50.

Количество лейкоцитов в крови здоровых животных приведено в таблице 1.