Методология исследования

Целью экспериментального исследования явилось изучение влияния электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию сигнальных молекул в культуре клеток эндотелия сосудов при ее старении [2, 3].

Для создания культур клеток материал аорты (диаметр 0,2 см, 8 фрагментов) без патологических изменений был получен от эмбриона человека (21 неделя гестации). Путем ферментативной диссоциации из материала аорты была получена первичная культура ткани эндотелия. Культуры клеток 3 пассажа определяли как «молодые», а 20 пассажа – как «старые» в соответствии с рекомендациями Международной ассоциации исследований клеточных культур. Для исследования культур клеток использовали гистологический и иммуногистохимический методы исследования. В качестве гистологической окраски образцов использовали гематоксилин и эозин. Для изучения культур клеток применяли метод иммуноцитохимии. Все полученные данные подвергали морфометрическому и иммуноцитохимическому анализу. В качестве молекул – маркеров функциональной активности эндотелия нами были выбраны эндотелиальнаяNO-синтаза (eNOS), эндотелин-1, вазопрессин, ангиотензин-2, тромбомодулин и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) В сердечно-сосудистой системе eNOS выполняет защитную функцию, поддерживая циркуляцию крови в сосудах. При воспалении и атеросклерозе eNOS снижает концентрацию NO и тем самым защищает эндотелиальные клетки от апоптоза. Повышенная продукция NO связана с развитием гипертензии, гиперхолестеринемии, сахарного диабета и сердечной недостаточности. Эндотелин-1, вазопрессин и ангиотензин-2 принимают участие в регуляции сосудистого тонуса. Эндотелин-1, связываясь с эндотелин А-рецепторами, снижает синтез NO в эндотелии и вызывает сужение сосудов. Присоединившись к рецепторам В-1, эндотелин-1 вызывает расширение сосудов (тормозится образование цАМФ и усиливается синтез NO). В норме эндотелин-1 синтезируется в небольшом количестве, и, реагируя с В-1-рецепторами, расширяет сосуды. Ангиотензин-2 и вазопрессин являются антагонистами NO, способствуя вазоконстрикции. Тромбомодулин является маркером повреждения сосудистого эндотелия. VEGF обеспечивает васкулогенез. Сосудистые эффекты VEGF включают стимуляцию миграции эндотелиальных клеток, их инвазию в базальную мембрану, пролиферацию, выживание и формирование фенестр, а также индукцию вазодилатации. Длительное снижение концентрации VEGF приводит к снижению выживаемости эндотелиальных клеток и повышению артериального давления. С целью изучить функциональную активность клеток эндотелия аорты человека для иммуноцитихимического исследования использовали первичные моноклональные антитела к маркерам проводили с применением мышиных моноклональных антител к маркерам ICAM-1 (Abcam, 1:100), VEGF (Dako, 1:100), eNOS (1:50, Novocastra), эндотелину-1 (1:100, Abcam), ангиотензину-2 (1:50, Dako), тромбомодулину (СD141) (1:100, Abcam) и вазопрессину (1:50, Dako), и вторичные антитела – биотинилированныеантимышиные иммуноглобулины. Для выявления мышиных иммуноглобулинов использовали универсальный биотин-стрептавидин-пероксидазный набор (MPBiomedicals). Субстратный фермент проявляли диаминобензидином (LiquidDAB+ SubstrateChromogenSystem, Dako). Cреда для культивирования клеток содержала87,5% M199, 10% FBS, 1,5% НЕРЕS, 1% PES и L-глутамин. Выделение первичной культуры (проводилось на чашках Петри (Sarstedt) обработанных раствором фибриногена (Gibco), последующее культивирование проводили во флаконах с обработанной поверхностью объемом 50 мл (Sarstedt 25 см²). Клетки выращивали в 5 мл культуральной среды на флакон и в 3 мл культуральной среды на чашку Петри диаметром 3,5 см, в 1 мл на одну лунку 24-луночного планшета. Через 5-7 дней первичная культура достигала монослоя и проводилась процедура ее пересеивания. Культивирование проводили до 3 пассажа («молодые» культуры клеток) и до 20 пассажа («старые» культуры клеток). На указанных пассажах после облучения клетки были рассеяны на 24 луночный планшет для иммуноцитохимического окрашивания. Воздействие на клетки проводили на 3 и 20 пассаже с помощью аппарата КВЧ-ИК терапии «Триомед», модификация «Универсал» (ООО «Триомед», г. Санкт-Петербург), который представляет собой источник низкоинтенсивного излучения (8-10 мкВт/см²) электромагнитных волн крайневысокочастотного и инфракрасного диапазонов для неинвазивного воздействия на участки кожного покрова человека (Рег.уд.ФСР № 2009/06554 от 17 августа 2012 г.). Для воздействия на культуру клеток излучатель подводили к горлышку культурального флакона и производили облучение в течение 5, 10 или 15 минут. В работе использовали программу модуляции № 1 по единому реестру программ производителя. Частота излучения составила 43 - 40 ГГц, частота модуляции несущей частоты была равна 10,0±0,5 Гц, длина волны – от 6,98 до 7,50 мм, средняя мощность излучения 0,1 мkВт. Все культуры были разделены на 4 группы: 1 – контроль (без воздействия), 2 – с воздействием на культуры в течение 5 минут, 3 - с воздействием на культуры в течение 10 минут, 4 - с воздействием на культуры в течение 15 минут. Для оценки результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическое исследование с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа NikonEclipse E400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе IntelPentium 4 и программного обеспечения VidiotestMorphology 5.0». В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении 200 и 400. Относительную площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Оптическую плотность экспрессии выявленных продуктов измеряли в условных единицах. Указанные параметры отражают интенсивность синтеза или накопления исследуемых сигнальных молекул. Статистическая обработка всех экспериментальных данных включала в себя подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каждой выборки и проводилась в Statistica 6.0. Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk’sW-test) Для проверки статистической однородности нескольких выборок были использованы непараметрические процедуры однофакторного дисперсионного анализа (критерий Крускала–Уоллиса). В случаях, когда дисперсионный анализ выявлял статистически значимую неоднородность нескольких выборок, для последующего выявления неоднородных групп применяли процедуры множественных сравнений с помощью критерия Манна-Уитни. Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,01.