Тема: Питательные среды и правила их приготовления

Цель:Ознакомиться с типами и назначением питательных сред, приготовить необходимые для дальнейшей работы среды.

Оборудование: Микроскоп, пенал с набором инструментов, весы, воронки, колбы 1 л, флаконы, марля.

Реактивы:Агар-агар, овсяные хлопья, картофель, глюкоза, минеральные соли для среды Чапека.

Для получения чистых культур грибов (факультативных сапротрофов и факультативных паразитов), поддержания их жизнеспособности в целях дальнейшего изучения применяют различные питательные среды. По консистенции различают жидкие и плотные питательные среды. Выбор того или иного типа питательного субстрата зависит от потребностей грибного организма и целей проводимого эксперимента.

Плотные среды готовят, добавляя к растворам солей и отварам агар (2-2,5%) или желатин (10-15 %), а, в случае необходимости, увлажняют поверхность твердых предметов (опилки и т.д.) растворами питательных веществ.

Плотные средыиспользуют для выделения грибов из естественных субстратов, получения культур из отдельных спор (моноспоровые изоляты), определения репродуктивной способности и особенностей спорообразования, дифференциации грибов по характеру роста на плотных средах, изучения влияния факторов среды и различных веществ на рост грибов.

Сыпучие среды (зерно, отруби) используют для приготовления больших количеств спорового посевного материала.

Приготавливая среды, надо иметь в виду следующие обстоятельства:

1) грибы обычно растут лучше на среде, богатой углеводами, но выращивание их на таких средах длительное время может редуцировать споруляцию;

2) большинство грибов предпочитает слабокислую реакцию (pH 6,0-6,5);

3) углеводы и белки в кислых и щелочных растворах разрушаются при нагревании, поэтому они должны быть умеренно стерилизованы или добавлены отдельно;

4) агар растворяют в половинной норме воды в течение 1-2 ч, а питательные вещества – в оставшейся воде, после чего компоненты смешивают;

5) агаризованная среда не затвердевает, если pH смещено в кислую или в щелочную сторону;

6) пептон, в основном, может быть исключен из состава сред, предназначаемых для грибов;

7) водопроводную воду следует предпочесть дистиллированной, поскольку первая содержит полезные микроэлементы; для грибов рода Phytophthora лучше использовать дистиллированную воду;

8) для сред, в состав которых входит растительный материал, из него предварительно делают вытяжку при низких (картофельный агар) или высоких (картофельно-декстрозный агар) температурах.

Жидкие питательные среды применяют для качественного и количественного изучения потребностей грибов в питательных веществах в процессах роста и синтеза метаболитов. В таких средах определяют влияние pH среды, микроэлементов, стимуляторов, ингибиторов и других веществ на биосинтетическую активность гриба.

Для подкисления сред употребляют соляную, серную, лимонную, молочную, фосфорную кислоты, для подщелачивания – NaOH или KOH.

Для усиления роста грибов и повышения их биосинтетической активности в питательные среды вводят микроэлементы. Железо, цинк, марганец и др. применяют в растворенном виде.

В качестве факторов роста используют тиамин, биотин, реже инозин, пиридоксин и др. Готовят исходные растворы этих соединений в 20-% -ном спирте, стерилизуют кипячением на водяной бане и хранят в холодильнике. Исходные растворы тиамина и пиридоксина должны содержать 100 мкг/мл; биотина – 5 мкг/мл.

Среди жидких сред наиболее распространенной и употребимой является среда Чапека (табл. 1) с pH 7,0. Можно заменять сахарозу глюкозой, NaNO₃ – NH₄Cl, доводить pH до 6,6 и ниже, употреблять водопроводную воду. Компоненты среды последовательно растворяют в воде, вносят агар-агар и расплавляют его. Затем добавляют сахарозу, устанавливают pH = 7,0. Среду разливают в посуду и стерилизуют 30 мин при температуре 117 °С (или 20 мин при 121 °С).

Таблица 1

Состав питательных сред для выращивания фитопатогенных грибов