Методика: Первый день.

Засевают водопроводную воду в объеме 333 мл (три объема по 100 мл, три – по 10 мл и три объема по 1 мл). При этом вода в объемах по 100 и 10 мл засевается в колбы и пробирки с 10 и 1 мл концентрированной ГПС, а посев воды в объеме 1 мл – в пробирки с 10 мл среды с нормальной концентрации. Посевы инкубируют в термостате 24 часа при 37⁰С.

Второй день. Учет результатов посева разных объемов воды:

- отсутствие помутнения, образования кислоты и газа в колбах и пробирках после посева воды, свидетельствуют о отсутствии кишечной палочки в исследуемом объеме воды;

- наличие кишечной палочки вызывает помутнение питательной среды, изменение цвета индикатора (красный цвет переходит в желтый) и появление пузырька газа в поплавках. Из подозрительных флаконов и пробирок проводят пересев штрихом на агар Эндо в чашках Петри, таким методом, чтобы появились изолированные колонии. Посевы инкубируют 24 часа при 37⁰С.

Третий день.Учет результатов посева на агарЭндо:

- при отсутствии роста на агаре Эндо или при наличии колоний, не характерных для БГКП, дается отрицательный ответ;

- из колоний, характерных для бактерий БГКП (красных с металлическим оттенком), готовят мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. Изучают культуру по оксидазному тесту. Для этого на фильтровальную бумагу пропитанную раствором нафтола-диэтил-n-фенилендиамина наносят штрихом 2-3 колонии снятые с агара Эндо. Для кишечной палочки характерно: наличие грамотрицательных палочек в мазке и отсутствие изменений в окраске фильтровальной бумаги на оксидазный тест, т.е. кишечная палочка, относится к оксидазоотрицательным бактериям. Наличие в мазках грамотрицательных бактерий, с отрицательной реакцией на оксидазный тест, позволяет дать положительный ответ на наличие БГКП в исследуемом объеме воды. Полученные результаты сравнивают с нормативами на питьевую воду.

При положительном результате на оксидазный тест бумага, пропитанная индикатором, приобретает ярко-синюю окраску (в течение минуты), положительную реакцию дают БГКП, которые не учитываются.

Для установления свежего фекального загрязнения воды посевы культивируют при 43⁰С для дифференциации кишечной палочки хладнокровных, не растущих при такой высокой температуре.

Метод мембранных фильтров

Суть этого метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема на мембранных фильтрах с выращиванием их на поверхности агара Эндо и последующим учетом количества БГКП в 1 л воды.

Первый день.Готовят прибор Зейтца – протирают спиртовым тампоном, обжигают в пламени спиртовки металлические детали (рис.9).

Рис. 9.Фильтр Зейтца с приемной колбой.

Готовят мембранные фильтры №3 из нитроцеллюлозы, с диаметром пор 0,7 мкм, которые задерживают на своей поверхности БГКП. Фильтры кипятят 10-15 мин в дистиллированной воде, затем с соблюдением правил асептики фильтр матовой поверхностью вверх кладут на сетку фильтрационного прибора Зейтца. В воронку прибора наливают

исследуемую воду, а в приемной колбе Бунзена создают вакуум при помощи водоструйного насоса. Исследуемая вода фильтруется через мембранный фильтр, бактерии, находившиеся в ней, остаются на поверхности. После окончания фильтрации воды мембранный фильтр матовой стороной вверх переносят на поверхность агара Эндо в чашках Петри (на одной чашке можно разложить четыре фильтра). Чашки ставят в термостат при 37⁰С на сутки. Через поры мембранного фильтра происходит диффузия питательных компонентов среды Эндо, вследствие этого оставшиеся БГКП размножаются и за сутки на поверхности фильтра образуют типичные колонии - красные с металлическим оттенком.

Водопроводная вода засевается (исследуется) в объеме 333 мл, которые последовательно пропускают через четыре фильтра по 200, 100, 30 и 3 мл воды.

Второй день. Учитывают наличие или отсутствие колоний на поверхности фильтров, находящихся на агаре Эндо в чашках Петри:

- отсутствие колоний на поверхности фильтра или наличие колоний не характерных для БГКП, позволяет дать отрицательный ответ на присутствие кишечной палочки в исследуемом объеме воды;

- при наличии на фильтре колоний, характерных для БГКП, красных с металлическим блеском, исследование продолжают. Для этого готовят препараты из подозрительных колоний, окрашивают по Граму, микроскопируют. При обнаружении грамотрицательных палочек, ставят оксидазную пробу (см. 187 стр.) – кишечная палочка относится к оксидазоотрицательным. При отрицательном результате оксидазного теста бумага на месте нанесения бактериальной культуры цвет не изменяет, следует учесть, что кишечная палочка относится к оксидазоотрицательным бактериям.

Результат выражают в виде коли-индекса, определяемого суммированием числа колоний кишечных палочек, выросших на поверхности всех мембранных фильтров из всех проб воды, и пересчета этого количества на 1000 мл воды. Зная показатель коли-титра, можно определить коли-индекс: для перевода коли-титра в коли-индекс 1000 делят на показатель коли-титра, а для перевода коли-индекса в коли-титр 1000 делят на число, выражающее коли-индекс.

Например, при исследовании пробы воды профильтровано 3 объема по 100 мл. На первом фильтре выросло 3, на втором фильтре выросло всего 2 колонии, на третьем – 10 колоний, т.е. в общей сложности на трех фильтрах выросло 15 колоний.

Коли-титр этой воды будет равен: 300 мл : 15 = 20 мл, т.е. 20 мл это наименьший объем воды, в котором находится одна кишечная палочка.

Теперь зная коли-титр мы определяем коли-индекс по формуле :

1000 1000

Коли-индекс этой воды = ------------- = --------- = 50

коли-титр 20

1000 1000

Коли-титр этой воды = --------------- = -------- = 20

коли-индекс 50

Таким образом, коли- индекс исследуемой воды равен 50, т.е. в 1000 мл воды находится 50 кишечных палочек.

Требования к санитарно-микробиологическому состоянию воды представлены в таблице 7.

Таблица 7

Микробиологические нормативы санитарного состояния воды

Из таблицы видно, что для питьевой воды установлены следующие бактериологические нормативы:

- количество МАФАнМ в 1 мл – не более 100;

- коли-титр - не менее 333;

- коли-индекс не должен превышать 3 кишечных палочек в 1000 мл.

Вода открытых водоемов считается доброкачественной, если количество МАФАнМ – не более 1000, коли-титр – не менее 111, коли-индекс – не более 9.

Наличие в воде патогенных бактерий устанавливают путем посева на дифференциально-диагностические и элективные питательные среды с последующей их идентификацией методами, принятыми в микробиологии.