ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА САПА, МЕЛИОИДОЗА И ПСЕВДОМОНОЗА НОРОК. БИОПРЕПАРАТЫ

Цель занятия. Ознакомить студентов со свойствами возбудите­лей и лабораторной диагностикой сапа, мелиоидоза, псевдомоноза норок и биопрепаратами.

Оборудование и материалы. Культуры P. aeruginosa на МПА в чашках Петри, в МПБ, набор тестов, характеризующих фермен­тативные свойства P. aeruginosa, покровные стекла для препарата «раздавленная капля», биопрепараты для специфической профилактики и диагностики сапа и псевдомоноза норок.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Сап. Это инфекционная, хронически протекающая болезнь однокопытных животных (лошади, ослы, мулы, лошаки); вос­приимчивы представители семейства кошачьих и человек. Характеризуется возникновением в легких, на слизистой оболочке носа и различных участках кожи специфических узелков, склон­ных к распаду с образованием гноящихся язв.

Возбудитель сапа — бактерия Pseudomonas mallei, род Pseudomonas, семейство Pseudomonadaceae.

Лабораторная диагностика сапа основана на результатах серо­логических исследований (РСК); бактериологическое исследова­ние проводят в исключительных случаях.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии и биопробы, выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию воз­будителя по культурально-морфологическим и ферментативным свойствам.

Материал для исследования. В лабораторию направляют кровь, гнойное отделяемое язв, носовые выделения, пунктат лимфати­ческих узлов, гной из абсцессов; от убитых животных берут учас­тки пораженной ткани легких, печени, селезенки, лимфатичес­ких узлов, носовой перегородки, трахеи, бронхов и др.

Микроскопия препаратов из исходного материала. В мазках из материала, окрашенных по Граму, возбудитель обнаруживают в виде прямых или слегка изогнутых, с закругленными концами грамотрицательных палочковидных бактерий размером (1,4...4) х 0,5 мкм, без спор и капсул (рис. 108). При окраске метиленовым синим Леффлера в клетках видна зернистость.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбудитель сапа —аэроб, температурный оптимум 37...38 °С, рН 6,8...7, луч­ше растет на средах с добавлением глицерина (2...4 %). Исследуе­мый материал высевают на глицеринизированных МПА и в МПБ. Рост возбудителя появляется на первые-вторые сутки, иногда позже.

В МПБ возбудитель растет с помутнением среды, на дне про­бирки образуется серо-белый слизистый осадок, на поверхности бульона может появляться пленка. На МПА возбудитель форми­рует гладкие, полупрозрачные, серовато-белые, с перламутровым оттенком колонии, постепенно сливающиеся в слизистый налет. Из выросших культур делают мазки, окрашивают по Граму, при микроскопии обнаруживают грамотрицательные полиморфные палочки; в бульонных культурах клетки возбудителя короче — вплоть до кокковидных.

Характерным считают рост на глицериновом картофеле: через двое - трое суток появляются мелкие, полупрозрачные, с желтова­тым оттенком колонии, которые затем сливаются в налет с жел­товатым оттенком («медовым»), к шестому—восьмому дню цвет меняется до буро-коричневого или красноватого.

У бактерий с типичными для возбудителя сапа культурально-морфологическими свойствами изучают ферментативные при­знаки. P. mallei медленно, на 6...8-е сутки, свертывает молоко, разжижает желатину, расщепляет с образованием кислоты без газа глюкозу, лактозу, не утилизирует сахарозу, мальтозу, ман-нит. В странах тропической зоны Юго-Восточной Азии выделя­ют возбудителя «ложного сапа» (мелиоидоза, болезни Уитмора) — P. pseudomallei, вызывающего заболевание человека и жи­вотных. Для дифференциации P. mallei и P. pseudomallei использу­ют признаки, указанные в таблице 32.

Биопроба. Готовят тканевую суспензию на стерильном физио­логическом растворе (соотношение 1:10) и вводят в объеме 0,5... 1 мл подкожно в область шеи золотистым хомячкам или в объеме 3...5 мл морским свинкам. Стерильно взятым материалом (пунктат) заражают животных внутрибрюшинно. В положитель­ных случаях на месте подкожной инъекции образуется язва с уп­лотненными краями, развивается конъюнктивит, ринит, у зара­женных внутрибрюшинно самцов морских свинок — орхит (фе­номен Штрауса). Гибель хомячков наступает на 5...7-е сутки, морских свинок — на 8...15-е сутки или же болезнь переходит в хроническую форму. Павших и убитых животных подвергают бактериологическому исследованию.

Серологическая диагностика основана на ре­зультатах РСК. Диагностическим титром сыворотки считают раз­ведение 1:10 при задержке гемолиза на четыре или три креста; задержку гемолиза на один, два креста при разведении сыворот­ки 1 : 10 и на три, четыре креста при разведении сыворотки 1:5 оценивают как сомнительный результат.

Аллергическая диагностика. Метод, применяемый в хозяйствах для контроля за благополучием лошадей по сапу (ставят офтальмопробу или внутрикожную пробу с маллеином).

Биопрепараты. Маллеин — диагностический сапной аллер­ген. При его изготовлении выращивают культуру возбудителя в глицеринизированном бульоне в течение четырех месяцев, стерилизуют автоклавированием, фильтруют через фильтр Зейтца, контролируют на стерильность, безвредность на белых мышах, специфичность — на здоровых лошадях, стандартизу­ют по активности в единицах действия на лабораторных жи­вотных.

Сапной антиген для РСК готовят следующим образом: агаро­вую культуру возбудителя смывают фенолизированным физиоло­гическим раствором, стерилизуют автоклавированием, отстаива­ют. В качестве антигена используют свободную от клеток культу-ральную жидкость, проверенную на стерильность, специфич­ность и активность.

Позитивная сапная сыворотка предназначена для определе­ния активности антигена (РСК) и в качестве контроля при по­становке РСК. Получают гипериммунизацией лошадей.

Мелиоидоз (ложный сап, болезнь Уитмора). Инфекционное за­болевание животных (лошади, собаки, кролики, мелкий рогатый скот) и человека, протекающее в форме острой или хронической септицемии или септикопиемии.

Возбудитель — бактерия Pseudomonas pseudomallei, род Pseudomonas, семейство Pseudomonadaceae.

Лабораторная диагностика мелиоидоза основана на результатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии и биопробы, выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию воз­будителя по культурально-морфологическим, ферментативным и серологическим свойствам.

Материал для исследования. В лабораторию направляют кровь, мокроту, мочу, гнойное отделяемое из абсцессов, участки пора­женных органов.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Возбудитель представляет собой полиморфную грамотрицательную палочку размером (1,5...6) х (9,5...10) мкм, с закругленными концами, спор и капсул нет; лофотрих. В мазках-отпечатках из органов располагается одиночно или компактными скоплениями.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбудитель — аэроб, температурный оптимум 37 ºС, рН 6,8...7,0, к питательным средам нетребователен. Исследуемый материал высевают на агар и в бульон с глицерином. При загрязнении материала посторонней микрофлорой его обрабатывают пенициллином (1000 ЕД/мл).

На плотных средах через 24 ч инкубирования возбудитель формирует мелкие, прозрачные, позднее мутнеющие беловатые колонии с металлическим блеском, могут появляться колонии Я-формы и крупные (до 7 мм) М-формы. На кровяном агаре, глицеринизированных средах растет с образованием колоний кремово-оранжевого цвета. На жидких средах через 24....48 ч вы­зывает помутнение среды, образование пленки, которая после добавления нейтрального красного приобретает оранжево-крас­ный цвет. Для бульонных культур характерен затхлый запах. Возбудитель в мазках из чистых культур располагается одиночно, па­рами, короткими цепочками или скоплениями по 5...7 штук.

У культур с типичными для P. pseudomallei культурально-морфологическими признаками исследуют ферментативные свой­ства. Возбудитель ферментирует с образованием кислоты глюко­зу, сахарозу, лактозу, мальтозу, галактозу, дульцит; декстрин, не образует индол и сероводород, медленно разжижает желатину, свертывает и пептонизирует молоко, гидролизует аргинин.

Выделенные культуры также идентифицируют в серологичес­ких реакциях: РА, РНГА, РП.

Биопроба. Суспензией из материала заражают внутрибрюшин­но (0,5... 1,0 мл) крыс и морских свинок. В положительных случа­ях животные погибают в зависимости от вирулентности штамма на 3...15-е сутки. У самцов морских свинок может развиться фе­номен Штрауса.

В качестве признаков для дифференциации P. mallei и P. pseudomallei используют морфологические критерии (см. табл.32), а также способность P.pseudomallei синтезировать на кровяном агаре кремово-оранжевый пигмент, пептонизировать молоко, гидролизировать желатину, при заражении вызывать ги­бель крыс.

Псевдомоноз норок. Остро протекающее инфекционное забо­левание. Характеризуется геморрагической пневмонией, призна­ ками сепсиса. Кроме норок восприимчивы лисицы, песцы; у жи­вотных других видов возбудитель может служить причиной пнев­моний, послеродовых, постхирургических осложнений.

Возбудитель псевдомоноза норок — бактерия Pseudomonas aeruginosa, род Pseudomonas, семейство Pseudomonadaceae.

Лабораторная диагностика псевдомоноза норок основана на ре­зультатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии, выделение чистой культуры посе­вом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным и серологи­ческим свойствам.

Материал для исследования. В лабораторию направляют пора­женные участки легких, регионарные лимфатические узлы, селе­зенку, печень, почки.

Микроскопия препаратов из исходного материала. P. aeruginosa в мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают в форме прямых или изогнутых грамотрицательных палочек длиной 0,5... 1,4 мкм, шириной 0,2...0,4 мкм, без капсул и спор; образует жгутики. Рас­полагается в виде одиночных клеток, коротких цепочек.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбуди­тель — аэроб, температурный оптимум 35...37 °С, к питательным средам нетребователен. Исследуемый материал высевают на МПА, в МПБ.

Через 24 ч рост P. aeruginosa в МПБ проявляется помутне­нием среды, образованием поверхностной пленки и серовато-белого осадка, за счет пигмента среда окрашена в сине-зеленый цвет, по мере старения культуры цвет колоний становится бурым. На МПА возбудитель формирует в основном два типа колоний: крупные (диаметр 2...5 мм), полупрозрачные, сероватые, гладкие, с плоскими краями и приподнятым центром, а также мелкие шероховатые. Штаммы, выделенные из респира­торного и мочеполового тракта, могут образовывать слизистые колонии. Среда вокруг колоний окрашена за счет пигмента в сине-зеленый цвет. Возбудитель синтезирует четыре типа пиг­мента: пиоцианин (сине-зеленый или желто-зеленый), флуо-ресцеин, пиорубин и черно-бурый пигмент. Для культивирова­ния P. aeruginosa при первичной изоляции из исследуемого ма­териала используют специальные селективные среды с анти­биотиками.

У выделенных культур изучают ферментативные свойства. Для P. aeruginosa характерны следующие признаки: образование аргининдигидролазы, оксидазы, гидролиз желатины, расщепле­ние глюкозы, бета-аланина, D-, L-аспарагина, денитрификация и способность к росту при 4l °С.

Вид гетерогенен по соматическим О-антигенам. Для иденти­фикации на уровне О-серогруппы используют РА на стекле, причем исследуют только культуры, у которых отмечены мини­мум два из трех физиологических признаков, характерных для вида: образование пигмента пиоцианина, расщепление глюко­зы, рост при 41...42°С. Используют набор из трех поливалент­ных и одиннадцати моновалентных сывороток. Антигеном слу­жит 18...20-часовая агаровая культура P. aeruginosa, инактивированная кипячением в водяной бане в течение 1,5 ч [концентра­ция (3...5)*10⁹/мл]. Антиген первоначально исследуют с поливалентными сыворотками, при получении положительного результата — с моновалентными, входящими в состав той или иной поливалентной сыворотки. Результат учитывают через 3...6 мин.

Биопрепараты. Моновалентную формолквасцовую вакцину против псевдомоноза норок готовят следующим образом: культу­ру вакцинного штамма (Шестой серотип) выращивают на пита­тельной среде, инактивируют формалином, адсорбируют на квасцах, контролируют на стерильность, безвредность, актив­ность.

Диагностические О-агглютинирующие сыворотки для серо-групповой идентификации P. aeruginosa включают в себя три по­ливалентные сыворотки: № 1 (03, 04, 05, 06, 07), № 2 (02, 08, 09), № 3 (010, 011, 012) и одиннадцать соответствующих моновалент­ных сывороток. Предназначены для идентификации P. aeruginosa на уровне О-серогруппы.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Ознакомиться с биопрепаратами для серологической и ал­лергической диагностики сапа.

2. Изучить морфологические, тинкториальные, культуральные и ферментативные свойства P. aeruginosa.

3. Ознакомиться с биопрепаратами для специфической про­филактики и диагностики псевдомоноза норок.

Контрольные вопросы

1. Каково значение бактериологического исследования для лабораторной диагностики сапа?

2. Какие иммунологические методы применяют для диагностики сапа?

3. Каковы биологические свойства возбудителя псевдомоноза норок?

4. Какие биопрепараты применяют для специфической профилактики псевдомоноза норок и серологической идентификации возбудителя?

5. В чем заключается бактериологическое исследование на мелиоидоз?

Тема 35