УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

В настоящее время разработаны различные методы оценки ток­сичности химических веществ, включающие острые, подострые и хронические исследования. Основное различие между ними со­стоит в применяемых дозах и продолжительности воздействия хи­мического вещества. Каждый из методов требует, чтобы группы здоровых лабораторных животных, содержащихся при соответ­ствующих условиях, подвергались воздействию градированных

доз исследуемого вещества. Для этих целей обычно используют крыс, мышей, морских свинок, кроликов, хомяков, но в некото­рых случаях может возникнуть необходимость включения в иссле­дование других видов животных. Как правило, контрольная груп­па животных получает растворитель (носитель исследуемого веще­ства) или инертное вещество. После воздействия вещества тщательно наблюдают за появлением признаков его токсичности. Лабораторные исследования, имеющие целью определение харак­тера биологического действия изучаемого вещества, выполняют на опытных и контрольных группах животных. Все данные в отно­шении каждого животного подробно записывают. По завершении исследования все животные, в том числе и контрольные, подлежат патоморфологическим исследованиям. Полученные данные долж­ны быть проанализированы с помощью соответствующих статис­тических методов.

Острым отравлением называют заболевание, возникающее после однократного воздействия токсического вещества. Оно име­ет место в случаях содержания вредного вещества, в десятки и сот­ни раз превышающего ПДК. Такое отравление может окончиться быстрым выздоровлением, вызвать стойкие нарушения здоровья либо оказаться смертельным. Острое отравление вызывают пары бензина, сероводород, бромистый метил, сероуглерод.

Хроническим отравлением называют заболевание, развивающее­ся после систематического длительного воздействия малых кон­центраций или доз вредного вещества. При однократном поступ­лении дозы этих веществ не вызывают симптомов отравления.

Наименьшие концентрации вредного вещества, вызывающие тот или иной эффект, называют пороговыми. Пороговые концент­рации, вызывающие острое отравление, всегда значительно боль­ше, чем вызывающие хроническое отравление.

В токсикологии выявляются пороги однократного, хроничес­кого действия вещества, его физиологический порог (минималь­ное воздействие вещества, в результате которого можно обнару­жить реакцию живого организма). Пороговые дозы и концентра­ции служат для количественного сравнения токсичности вещества на относительно низком уровне. При выявлении порогов исполь­зуют такие показатели реакций, как двигательная активность, масса опытного животного, мышечная сила, нервно-мышечная возбудимость, состояние терморегуляции, функции печени, по­чек, сердечно-сосудистой системы, биохимические показатели крови. В опыте яды вводятся подкожно, внутрибрюшинно, перорально, с помощью ингаляционных затравок. Для газов и паров же­лательно определить их пороговые концентрации в воздухе. Опы­ты с животными дополняют исследованиями на людях-доброволь­цах. Определение пороговых концентраций в хроническом опыте длится не менее 4 мес. Безопасные, предельно допустимые кон­центрации (ПДК) вредных веществ в несколько раз ниже пороговых, вызывающих физиологические нарушения при резорбтивном однократном воздействии. Особенно малы ПДК тяжелых металлов.

Острая токсичность определяется как вредное действие, про­являющееся в течение короткого периода после введения разовой дозы или многократных доз, вводимых в течение суток. Исследо­вание острой токсичности направлено на установление количе­ственных параметров токсичности данного химического соедине­ния, изучение характера его действия и специфического токсичес­кого эффекта, а также на установление существующих видовых и половых различий в чувствительности к токсическому агенту.

Все дозы или концентрации ядов, вызывающие тот или иной эффект при воздействии на организм, условно делят на смертель­ные дозы или концентрации (LD и LQ и несмертельные, или эффек­тивные, вызывающие любой эффект, кроме смертельного (ED и ЕС). Смертельной дозой называют количество вещества, посту­пившего в организм и вызвавшего гибель животных. Критериями оценки токсических эффектов веществ являются величины LD0, /,016, Z,/)50, LDs4, LD]00 (или ZQ, LC16, LC50, />C84, ICIOO), соответ­ствующие дозам (или концентрациям) вещества, вызывающего гибель в эксперименте 0, 16, 50, 84 и 100% подопытных живот­ных. Дозы воздействующего вещества выражаются в единицах массы или объема яда на единицу массы животного (мг/кг или мл/кг), а его концентрации — в единицах массы на единицу объе­ма (мг/м3, мг/л), в процентах, в частях на миллион.

Зависимость между дозами (концентрациями) действующих веществ (по оси абсцисс) и эффектом в виде процента погибших животных (ось ординат) может быть выражена графически в виде кривых доза — эффект, чаше имеющих S-образную форму (см. да­лее рис. 2.1, Б).

Наиболее часто используемые тесты на острую токсичность включают определение средней летальной (смертельной) дозы (LD₅o) соединения. LD₅₀ определена как «статистически получен­ное выражение разовой дозы вещества, которая вызывает гибель 50 % животных». Основная методическая схема установления LD₅₀ хорошо разработана и состоит в затравке групп животных матема­тически связанной серией доз для определения дозы, вызываю­щей гибель 50 % животных опытной группы, путем определения функции доза—ответ. Значение LD₅₀ обычно определяют путем расчетов. Гибель животных после однократного воздействия ве­щества может наступить не сразу: сроки смерти зависят от меха­низма действия вещества, поэтому в токсикологии принято на­блюдать за животными в течение 14сут.

Если вещество не обладает выраженной токсичностью, то оп­ределить смертельные дозы, даже вводя максимально возможные объемы вещества, не удается. В таких случаях, чтобы получить примерные сведения о верхних параметрах токсичности, продолжают ежедневное введение возможно большей дозы, регистрируя время гибели животного и суммарное количество введенного яда. Оценку результатов производят на основании среднего эффектив­ного времени гибели животных. Следует отметить, что при ис­пользовании этого метода не требуется достижения гибели всех животных группы.

Пороговая, или минимальная, токсическая доза при однократ­ном введении токсического вещества определяет нижнюю зону ос­трой токсичности вещества. Но уловить те слабые функциональные изменения, которые характеризуют пороговое действие, не­легко. В таких случаях наиболее применимы интегральные методики.

При выявлении верхнего параметра токсичности вещества сле­дует учитывать, как быстро наступают симптомы отравления и смерть. Эти наблюдения могут в какой-то степени характеризо­вать токсикодинамику яда. Обычно можно разграничить несколь­ко стадий острого отравления: 1) скрытая стадия, которая продол­жается от момента введения яда до первых признаков его действия на организм; 2) продромальная стадия, характеризующаяся на­чальными, неясными и нетипичными явлениями; 3) стадия нарас­тания отравления; 4) стадия высшего развития, когда все симпто­мы отравления, представляющие характерную для данного яда картину, достигают наибольшей силы. Эта стадия заканчивается гибелью животного или переходит в пятую стадию разрешения, когда начинается явное уменьшение действия яда.

При действии больших доз, когда смерть наступает почти мо­ментально или в очень короткие сроки, выявить отдельные стадии отравления не представляется возможным.

В ряде случаев после отравления, иногда даже однократного, можно отметить так называемое метатоксическое действие яда. Под этим термином понимают наличие более или менее отдален­ных последствий отравления, не связанных с непосредственным действием яда. Показательным примером может служить пораже­ние почек, обнаруживаемое спустя длительное время после пере­несенного отравления сулемой.

При изучении картины острой интоксикации учитывают время развития отравления, сроки гибели животного, а при выжива­нии — быстроту восстановления функций организма.

При проведении токсикологического эксперимента многое за­висит от умения экспериментатора наблюдать за животными, за появлением тех или иных симптомов отравления, чтобы, сумми­ровав их, выявить характерное действие яда.

Воздействие токсических веществ оценивают по изменению внешнего вида, состояния и поведения животных: наблюдают за двигательной активностью и координацией движений (характер походки, сохранение равновесия и т.д.), выявляют наличие тикообразных движений головы, тремора, судорог и их характер (клинические, тонические), парезов и параличей, определяют тонус мускулатуры путем пальпации различных групп мышц животного, выявляют реакции животного на звуковые, тактильные и болевые раздражители.

Токсические вещества в начале своего действия часто вызыва­ют у животных явления возбуждения центральной нервной систе­мы, как правило, сопровождающиеся повышенной двигательной активностью. Животные усиленно, часто беспорядочно, двигают­ся, прыгают, бросаются на стенки клетки. Иногда наблюдаются явления стереотипии: например, мыши бегают по кругу, крысы вращаются вокруг своей оси, как бы вальсируют. Реакция живот­ных на незначительные раздражения бывает резко повышенной вплоть до агрессивной. У мышей иногда наблюдается симптом Штрауба: мышь держит хвост вертикально, «трубой», за счет ги­пертонуса приводящих мышц, что свидетельствует о распростра­нении возбуждения на нижележащие области центральной не­рвной системы, в частности на спинной мозг. Походка у живот­ных становится шаткой, движения — некоординированными. Начинаются судорожные явления. При этом признаки возбуж­дения нередко сменяются угнетением центральной нервной си­стемы. Явления угнетения в зависимости от механизма дей­ствия яда могут возникнуть и с самого начала отравления, без предварительного периода возбуждения. Животные перестают двигаться, иногда как бы «застывают» на месте, сбиваются в куч­ку. Реакция на раздражители сначала понижается, а затем жи­вотные вообще перестают реагировать на какие бы то ни было раздражители, в том числе и болевые. Наступает так называемое боковое положение, в некоторых случаях, когда тонус мышц по­вышен, животным можно придавать любое, даже неестественное положение. Боковое положение может переходить в коматозное состояние.

На основании изучения поведения животных выясняется кар­тина возбуждающего или угнетающего действия яда на централь­ную нервную систему. Возможно даже примерно определить ту часть нервной системы, которая задета действием исследуемого вещества.

Характерным признаком воздействия яда часто является изме­нение цвета кожных покровов.

Одним из наиболее постоянных симптомов отравления служит изменение дыхания. Изменяются глубина дыхания и его ритм. Одно из типичных нарушений ритма дыхания характеризуется тем, что после нескольких, иногда все углубляющихся дыхатель­ных движений наступает дыхательная пауза, продолжающаяся 5—10 с. Затем опять следует несколько дыханий, опять пауза и так далее (так называемое дыхание Чейн—Стокса). Изменяются коли­чественные показатели: дыхание может настолько ускориться, что его трудно визуально сосчитать, или, наоборот, замедляется так,

что его, например, легко учесть у мышей, у которых в норме визу­ально определить частоту дыхания довольно сложно.

Изменение сердечной деятельности также служит ярким пока­зателем действия яда.

Часто, особенно при введении токсических веществ в желудок, преобладают патологические явления со стороны желудочно-ки­шечного тракта (рвота, понос, запор, отказ от еды и т. п.). Следует обращать внимание на изменение цвета, консистенции, частоты испражнений. У мышей подсчитывают число дефекаций за 1 ч или 2ч. Имеют значение изменения мочи, частота мочеотделе­ния.

Учет данных, полученных при наблюдении за отравленными животными, позволяет определить характерные особенности в действии яда.

Погибших животных, а также выживших, которых умерщвляют по окончании срока наблюдения с помощью наркоза (эфиром или барбитуратами), а также диоксида углерода, подвергают патолого-анатомическому исследованию, сравнивая их с контрольными.