КРИТЕРИИ ТОКСИКОМЕТРИИ

Токсикометрия — это преимущественно экспериментальный раздел токсикологии. Получение количественных оценок дей­ствия ксенобиотиков требует реализации трех исследовательских этапов: планирования эксперимента, его проведения и получения количественных оценок, интерпретации результатов.

При этом прежде всего учитывают показатели токсичности ис­следуемого вещества, его потенциальную опасность, концентрации яда в окружающей среде или его дозы (при попадании веще­ства в организм, например, через рот), способные вызвать отрав­ление.

Чаше всего термин «доза» служит для обозначения количества введенного в организм химического вещества, выражаемого обыч­но на единицу массы тела.

Величина LD₅₀ имеет вероятностный характер. Некоторые спо­собы определения LD₅₀ основаны на предположении о «нормаль­ности» кривой доза—эффект. В этом случае кроме характеристики положения Юм статистическая совокупность экспериментальных данных по определению смертельной дозы того или иного веще­ства должна еще иметь характеристику рассеяния. Такой характе­ристикой является величина среднеквадратического отклонения (ошибки)— σ_LD50 .Следовательно, наиболее определенной, а мо­жет быть, и наилучшей количественной характеристикой токсич­ности яда в зоне смертельных доз будет величина LD₅₀ и ее среднеквадратическая (стандартная) ошибка— σ_LD50

Если величину LD₅₀ определяют почти всегда, то ее стандарт­ную ошибку (σ_LD50)— значительно реже. Это приводит к тому, что существенная часть экспериментально собранной информа­ции о токсичности того или иного яда, во-первых, не использует­ся самими авторами, а во-вторых, не может быть использована другими исследователями.

Таким образом, среднесмертельная доза изучаемого вещества должна представляться в виде величины: LD₅₀ ± σ_LD50

Однако токсический эффект определяется не только количе­ством яда, но и временем его воздействия. Действие ядов в зависи­мости от дозы или концентрации обычно по-разному развивается во времени. Следовательно, токсический эффект всегда есть ре­зультат взаимодействия трех факторов: организма, количества ве­щества и времени.

Связь между дозой вещества, временем и эффектом может быть представлена в виде поверхности в трехмерном пространстве. При сечении этой поверхности плоскостями, параллельными коорди­натным плоскостям, получаются три семейства кривых, попарно связывающих дозу яда, время и эффект. Эти попарные зависимос­ти между двумя величинами (при постоянном значении третьей, чаще временной величины) и являются предметом исследования токсикологов. В соответствии с числом пар, которые могут быть составлены из трех рассматриваемых величин, принципиально возможны три типа токсикологических экспериментов:

• эксперименты по установлению связи между дозой или кон­центрацией яда и токсическим эффектом. Такие эксперименты осуществляются наиболее часто. К ним относятся, например, опыты по определению среднесмертельных доз и концентраций;

• эксперименты по установлению зависимостей между време­нем воздействия яда и эффектом. В ряде случаев зависимости время — эффект имеют большое значение, например, при установле­нии предельно допустимых концентраций вредных веществ для атмосферного воздуха;

• эксперименты по установлению связей между дозой или кон­центрацией яда и временем наступления фиксированного токси­ческого эффекта. Примером экспериментов, относящихся к этому типу, являются опыты по изучению кумулятивных свойств ядов.

Количество яда и величина эффекта, связь которых изучается в опытах трех перечисленных типов, выражаются в соответствую­щих единицах концентрации или дозы воздействующего веще­ства. И концентрацию, и дозу вещества можно выразить в долях от дозы или концентрации, вызывающей определенный эффект, например от дозы, вызывающей 50%-ю гибель животных (0,5 LD₅₀ ,01LD₅₀ и т. д.).

Объем эффекта выражают либо количеством животных, на ко­торых достигнут определенный результат в течение определенного срока наблюдения за ними (например, процент гибели животных в течение первых суток после введения яда), либо по среднему ре­зультату проявления эффекта (например, по времени гибели по­ловины подопытных животных). В первом случае говорят об аль­тернативном эффекте, во втором — о градированной (градацион­ной) зависимости эффекта от воздействующего агента. При учете реакции в альтернативной форме для каждого животного доста­точно определить наступление или отсутствие эффекта. При учете же результата в градированной форме для каждого животного не­обходимо установить степень достигнутого эффекта. Понятно, что для учета реакции в градированной форме необходимы более тон­кая методика и индивидуальный подход к каждому животному. Таким образом, рассматривая вопрос об изучении зависимостей между дозой яда, временем и эффектом, следует иметь в виду воз­можность проведения шести видов токсикологических экспери­ментов: три типа по два варианта в каждом — в зависимости от формы учета эффекта (альтернативной или градированной).

ПЛАНИРОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТА

Токсический эффект — результат взаимодействия организма и токсиканта. При изучении токсичности веществ необходим все­сторонний учет не только особенностей организма, но и исследуе­мого токсического агента. На этой стадии проводят анализ лите­ратурных данных о характере биологического действия, токсично­сти и опасности известных аналогов изучаемого вещества.

Природа или характер токсического действия, присущего дан­ному химическому веществу, в значительной степени зависит от функциональной группы или групп, входящих в молекулу веще­ства. Знание реакций, в которые могут вступать эти функциональные группы с реакционно-способными группами критических эн­догенных биохимических компонентов, дает возможность про­гнозировать характер ожидаемого токсического действия.

По таким физико-химическим константам, как молекулярная масса (М_г), температура кипения (t/_кип), плотность (d), и некото­рым другим можно установить степень корреляции с параметрами токсикометрии. Опираясь на твердо установленные связи между структурой, физико-химическими свойствами и действием изуча­емых веществ, можно в известной степени синтезировать близкие по строению и составу вещества.

Однако оценка токсичности на основании аналогии с химичес­ки родственными веществами в значительной мере чревата ошиб­ками и требует большого объема токсикологической информации, характеризующей очень близкие по химическому строению веще­ства. Даже незначительные различия в химической структуре мо­гут сопровождаться значительными изменениями в токсичности.

Предварительная оценка степени токсичности вещества может быть произведена при однократном введении путем установления верхней и нижней границ диапазона его токсического действия, т. е. смертельной и пороговой доз. Верхний и нижний параметры токсичности определяют зону острого токсического действия. Опасность острого отравления устанавливается шириной этой зоны. Чем она уже, тем более возможно острое отравление.

Верхние параметры токсичности представляют собой смер­тельные дозы, т. е. количества вещества, которые при введении в организм вызывают гибель определенного количества животных в опытной группе.

Практически определение верхнего параметра токсичности производят на основании анализов результатов испытания ряда последовательно возрастающих доз вещества с использованием для каждой дозы определенной группы животных одного вида: от дозы, не вызывающей ни одного случая смерти, до дозы, приводя­щей к гибели всех животных в группе. Учитывают зависимость между дозой вещества и частотой наступления летального исхода.

В начале острого опыта в первую очередь надо установить, в ка­ких цифровых порядках находятся параметры токсичности. Целе­сообразно в целях выявления доз, лежащих в зоне летального дей­ствия, вначале использовать для каждой дозы не более одного-двух животных. Опыты с необходимым для статистики числом животных начинают от той дозы, при введении которой в ориен­тировочном опыте животное осталось живым, в то время как от всех более высоких доз животные погибали.

Некоторые авторы рекомендуют в предварительных опытах оп­ределять порядок смертельных доз, испытывая дозы, кратные 10 (например, 5, 50, 500, 5000 мг/кг).

Так как для проведения полного опыта по установлению пара­метров токсичности требуется в общей сложности довольно большое количество животных, то чаше для этой цели используют мышей. При установлении смертельных параметров для животных других видов можно использовать меньшее количество особей, других видов применив метод Ван дер Вердена

Испытуемые дозы должны различаться на равные численные значения. При выборе доз обычно прибегают к арифметической прогрессии (например, 1, 2, 3, 4, 5 и т.д. или 5, 10, 15, 20 и т.д.). Но дозы, взятые в арифметической прогрессии, разнятся между собой некратно. Так, дозы 5 и 10 разнятся в 2 раза, а дозы того же ряда 50 и 55 — лишь на 10%. Это заставило некоторых авторов предложить пользоваться при выборе доз геометрической прогрес­сией (например, 1, 2, 4, 8, 16, 32 и т.д. или 0,1, 0,01, 0,001 и т.д.) или применять ряды Фульда. Эти ряды представляют собой геомет­рические прогрессии с начальным членом 10ⁿ и знаменателем , где л—любое целое положительное или отрицательное число, а m — любое целое положительное число, отличное от нуля. Удобство этих рядов заключается в том, что они содержат одни и те же соот­ношения во всех разрядах единиц. Конкретный ряд рекомендуется выбирать в зависимости от количества используемых для опыта жи­вотных. Например, для опытов, где каждую дозу испытывают на пяти-шести животных, подходят следующие ряды:

1,0 - 1,5 - 2,1 - 3,2 - 4,6 - 8,8 - 10,0 - 15,0;

1,0 - 1,4 - 1,9 - 2,7 - 3,7 - 5,2 - 7,2 - 10,0 - 14,0.

Для опытов, в которых дозу испытывают на 10 животных, мож­но применить ряды:

1,0 - 1,3 - 1,8 - 2,4 - 3,2 - 4,2 - 5,6 - 7,5 - 10,0 - 13,0; 1,0 - 1,3 - 1,7 - 2,1 - 2,8 - 3,6 - 4,6 - 6,0 - 7,7 - 10,0 - 13,0; 1,0 - 1,3 - 1,6 - 2,0 - 3,2 - 4,0 - 5,0 - 6,3 - 8,0 - 10,0.

После того как приблизительное значение эффективных доз найдено, приступают к основному эксперименту. Подопытных животных разделяют на равные по численности группы — по 6—10 животных в каждой группе. На каждой группе испытывают одну дозу. Всего испытывают пять—восемь доз, доходя с одной стороны до дозы, не вызывающей учитываемой реакции ни у од­ного из животных в группе, и с другой стороны до дозы, вызываю­щей эту реакцию у всей группы животных. Во всех случаях жела­тельно, а для некоторых методов необходимо, чтобы интервал между испытываемыми дозами был постоянным.

Следует стремиться к тому, чтобы весь опыт был проведен в те­чение одного дня. Если это невозможно, то рекомендуют ежед­невно испытывать весь ряд доз на меньшем количестве животных.

При изучении токсичности следует считать обязательным пра­вилом вскрытие каждого погибшего животного, с тем чтобы исключить из эксперимента животных, смерть которых могла насту­пить не из-за действия токсического агента. Так, при внутрибрю-шинном введении вещества возможно повреждение кровеносных сосудов, о чем будет свидетельствовать значительное количество крови в брюшной полости. В случае введения токсиканта внутри-желудочно возможно повреждение пищевода или ошибочное вве­дение вещества в трахею.

В результате эксперимента исследователь получает данные о ко­личестве животных, у которых под влиянием испытанных доз ве­щества наблюдалась или не наблюдалась учитываемая реакция. Эти данные заносят в таблицу, в которой результат эксперимента обычно записывают в виде дроби: в числителе указывают число животных, у которых наблюдалась учитываемая реакция, в знаме­нателе — число животных, у которых эта реакция не наблюдалась, либо общее число животных в группе.

.