Метод полимеразной цепной реакиции (ПЦР)

Принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (polymerase chain reaction - PCR) был разработан Кэри Мюллисом (фирма “Cetus”, США) в 1983г. Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определенного участка ДНК. В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. В настоящее время ПЦР широко используется как для научных исследований, так и для решения прикладных задач (генотипирование, диагностика инфекционных заболеваний, судебная медэкспертиза и т.д.).

Этот метод представляет собой эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификации (увеличение числа копий) — иногда в миллионы раз — осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса. Для осуществления ПЦР необходимы:

• два синтетических олигонуклеотидных праймера (длиной 20-25 нуклеотидов), комплементарные участкам ДНК из противоположных цепей, фланкирующим последовательность-мишень; их 3’–ОН концы должны быть ориентированы навстречу друг другу;

• ДНК-матрица длиной от 100 до 35000 п.н. (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент);

• термостабильная ДНК-полимераза, которая не теряет своей активности при температуре 95° С и выше;

• смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (смесь четырех дНТФ является субстратом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК);

• буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg^2+, необходимые для поддержания активности фермента).

Стандартная ПЦР-амплификация представляет собой многократное повторение следующих трех реакций (рис. 43 - 1).

1. Денатурация образца ДНК выдерживанием его при температуре 93 - 95° С в течение по крайней мере 1 минуты. Помимо ДНК в реакционной смеси содержатся в избытке два праймера, термостабильная ДНК-полимераза Taq, выделенная из бактерии Termus aquaticus и четыре дНТФ.

2. Ренатурация или отжиг. Температуру смеси медленно понижают до оптимальной температуры спаривания матрицы ДНК и праймеров. Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на границах специфического участка противоположных цепей ДНК. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65^оС. Время отжига занимает 20-60 сек.

3. Синтез ДНК или удлинение праймера. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5’-конца к 3’-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (англ. dNTPs). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72^оС. Время протекания синтеза - 20-60 сек.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). (рис. 43 - 3). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2ⁿ, где n-число циклов амлификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 10⁸ молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле.

Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

Рис. 43. Схема первых трех циклов полимеразной цепной реакции

Амплифицированный in vitro специфический фрагмент ДНК получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования, т.е. для определения последовательности нуклеотидов в его цепи. Поскольку при этом не требуется промежуточный этап клонирования фрагмента ДНК в генетических векторах, ПЦР иногда называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning). Автоматизированная процедура Taq-полимеразной цепной реакции, состоящая из 30 и более циклов, занимает 3—4 часа, что существенно быстрее и проще процедуры клонирования определенного фрагмента ДНК в составе рекомбинантных ДНК.

Метод ПЦР произвел настоящую революцию в биотехнологии. Он позволяет в миллионы раз амплифицировать in vitro нужные сегменты ДНК. Некоторые из направлений применения метода ПЦР:

· идентификация патогенных микроорганизмов, возбудителей заболеваний человека, животных и растений;

· выявление спонтанных мутаций;

· внесение специфических мутаций in vitro (направленный мутагенез);

· введение адаптеров для создания сайтов рестрикции в амплифицированных фрагментах с дальнейшим клонированием последних, например, в клетках E.coli (рис. 44);

· сборка полноразмерных генов из синтетических олигонуклеотидов;

· секвенирование ДНК и др.

Рис. 44. Введение сайтов рестрикции с помощью ПЦР

ПЦР можно провести всего за один день, ее легко автоматизировать, реакция сравнительно недорога и чрезвычайно специфична.