ПЦР в реальном времени.
В настоящее время широкое распространение в исследовательских и диагностических лабораториях получила новая технология ПЦР — ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Ее принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов (рис. 45)
Рис. 45. Кинетическая кривая ПЦР в координатах
1. Стадию инициации (когда ПЦР-продукты еще не
детектируется флуоресцентной меткой).
2. Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается
экспоненциальная зависимость количества
флуоресценции от цикла ПЦР).
3. Плато – стадию насыщения.
Real-time PCR - это семейство методик количественного ПЦР со следующими чертами:
· определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации;
· построение по этим данным кинетической кривой ПЦР;
· определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой.
ПЦР в реальном времени использует флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации (рис. 46). Детектируемая прибором флуоресценция, прямо пропорциональна количеству ПЦР-продукта, ее обозначают как - репортерная флуоресценця. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются в зависимости от типа real-time ПЦР.
Детекция сигнала флуоресценции в ходе реакции позволяет наблюдать процесс накопления продукта во время ПЦР, а не после окончания реакции. Сигнал флуоресценции в ходе ПЦР возрастает пропорционально количеству продукта амплификации. Мониторинг сигнала позволяет построить кинетическую кривую реакции, при этом момент заметного увеличения сигнала и отрыва его от фонового – так называемый пороговый цикл – зависит от исходного количества ДНК-мишени. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции и тем меньше пороговый цикл.
Рис. 46. Схема, представляющая систему использования флуорфоров при проведении ПЦР в реальном времени
Основные преимущества ПЦР в реальном времени по сравнению с методом анализа по конечной точке:
· количественный анализ специфической ДНК в широком диапазоне концентраций;
· сравнительный количественный анализ нескольких типов ДНК в одной пробирке;
· повышение специфичности реакции за счет использования гибридизационных зондов;
· обнаружение и определение процентного содержания ДНК с измененной последовательностью;
· исключение послеамплификационных манипуляций с продуктом и, как следствие, снижение риска контаминации (загрязнения), экономия времени и сокращение затрат на поддержание ПЦР-лаборатории;
· автоматизация и стандартизация ПЦР-анализа.
Дата добавления: 2016-07-18; просмотров: 2508;