И иммобилизация ферментов

Все встречающиеся в природе организмы содержат ферменты (биокатализаторы), функцией которых является проведение и регуляция химических реакций, необходимых для жизни. Энзимология – раздел молекулярной биологии и биохимии, изучающий свойства, строение и механизмы действия ферментов. Основная задача инженерной энзимологии состоит в создании новых перспективных технологий на основе использования ферментов. Ферменты применяются в следующих областях:

1. В пищевой промышленности – для производства хлеба, переработки молочных продуктов, осветления соков и др.

2. В медицине – для производства лекарственных препаратов.

3. В животноводстве – для повышения усвояемости кормов, а также для ускорения процесса силосования и улучшения питательных свойств силоса.

4. В растениеводстве – для защиты растений от насекомых - вредителей.

Источники получения ферментов.

Ферменты выделяют из клеток всех видов живых организмов, но традиционным источником служат растения.

Синтез ферментов клетками культуры ткани ввиду сложности и дороговизны не получил широкого распространения, хотя он и позволяет получить большое количество необходимого вещества в десятки, а иногда в сотни раз быстрее, чем путем выделения из живых организмов. В настоящее время ферменты получают преимущественно из бактерий, так как они примерно в сто раз дешевле ферментов, выделенных из клеток растений и животных.

Высокопродуктивные штаммы микроорганизмов получают благодаря использованию мутационного процесса и методов генетической инженерии. Сочетание этих методов позволило японским исследователям добиться 200 – кратного увеличения синтеза альфа – амилазы клетками сенной палочки Bacillus subtilis.

Причины иммобилизации ферментов.

Выделяемые из клеток свободные ферменты имеют ряд недостатков:

1. Они растворимы в воде и во время выделения или при хранении могут потерять свою активность.

2. Их порой трудно отделить от продуктов реакции.

В последнее время были найдены пути преодоления этих сложностей – получены водонерастворимые формы, так называемые иммобилизованные (связанные) ферменты.

Способ иммобилизации и его преимущество.

Иммобилизация – это метод, позволяющий связать молекулу фермента с природным или синтетическим носителем. Носитель не смешивается с растворами реагентов, но позволяет ферменту взаимодействовать с ними, в результате чего и образуются необходимые вещества. Наиболее распространенным способом получения иммобилизованных ферментов является ковалентное связывание (рис.10.1). Иммобилизованные ферменты обладают существенными преимуществами по сравнению с традиционными ферментативными препаратами: 1. Они стабильны и долго сохраняют свою активность; 2. Легко отделяются от реакционной среды, что повышает качество получаемой продукции. 3. Иммобилизованные ферменты технологичны, что определяется возможностью вести биотехнологический процесс непрерывно, регулировать скорость реакции и выход продукции.

Сущность иммобилизации ферментов - прикрепление их к активной форме к нерастворимой основе, заключение в гель или в полунепроницаемую мембранную систему. Фиксированные таким образом ферменты обладают пролонгированным (более длительным) действием.

Ещё в 1916 году Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что сахароза, сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую активность, но лишь в 1953 году Н. Грубхофер и Д. Шлейт впервые осуществили ковалентные связывания амилазы, пепсина и карбоксипептидазы с этим нерастворимым носителем.

В 1981 году на первой конференции по инженерной энзимологии был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают более широкий смысл, чем связывание на нерастворимом носителе, а именно – полное или частичное ограничение свободы движения белковых молекул.

Ферментинвертаза.

Фермент инвертаза расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу, его получают из пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces carlsberqensis) (рис 10.2).

Инвертный сахар кристаллизуется медленнее, чем сахароза, поэтому его применяют при изготовлении продуктов, в которых кристаллизация нежелательна – в полужидких начинках конфет, в ликерах, сиропах, в искусственном меде.

Получаемая с помощью инвертазы фруктоза оказывает благоприятное действие на организм больного человека.

Фруктоза применяется: 1.В питании людей, больных диабетом. Ее расщепление не зависит от инсулина, что способствует нормализации синтеза гликогена в организме. 2.Фруктоза улучшает усвоение препаратов, содержащих железо, поэтому ее можно использовать при лечении анемии, вызванной недостатком ионов железа в организме. 3. Улучшает состояние людей, страдающих сердечной недостаточностью. 4. Она предотвращает накопление жира в печени. 5.Фруктоза снижает заболеваемость кариесом.

Лактаза – фермент, который расщепляет лактозу (сахар, содержащийся в молоке) на галактозу и глюкозу. Лактоза с трудом усваивается животными организмами, не сбраживается хлебопекарными дрожжами. Слабая растворимость лактозы мешает переработке молока. Применение иммобилизованной лактазы позволяет: 1. Получать концентрированные молочные продукты. 2. Избегать добавления химических стабилизаторов в мороженое. 3. Увеличить питательность смесей для детского питания. 4. Осуществлять ферментативный гидролиз лактозы в молочной сыворотке, что позволяет применять ее в качестве корма для животных и птицы.

Ферменты сохраняют свои уникальные свойства (эффективность, специфичность действия) вне клеток, поэтому их традиционно широко применяют в практике. Они являются нетоксичными биологическими катализаторами, оказывающими «мягкое» воздействие. Используется доступное сырьё (в том числе отходы), поэтому их получение в выгодно с экономической и экологической точек зрения.

По объёму производства ферменты занимают третье место после аминокислот и антибиотиков. Из более 2000 известных в настоящее время ферментов в промышленности используется около 30. Основная часть ферментов, поступающих на мировой рынок, приходится на долю гидролаз, из которых 60% составляют пептидогидролазы, использующиеся в качестве детергентов в производстве синтетических моющих средств, а 30% – гликозидазы, применяющиеся в производстве кондитерских изделий, фруктовых и овощных соков. Ферменты находят применение в текстильной, кожевенной, целлюлозобумажной, медицинской, химической промышленности.

По прогнозам учёных, основным потребителем ферментов в ближайшем будущем остаётся пищевая промышленность. Главное место среди этих энзимов занимают глюкоизомераза и глюкоамилаза, применяющиеся для приготовления обогащённых фруктозой кукурузных сиропов и составляющие около 50% рынка пищевых энзиматических препаратов.

Для деградации и модификации органических соединений, поступающих в окружающую среду, используют ферменты пептидогидролазы. Перспектива для очистки сточныхвод -новая технология, основанная на использовании реакции пластеинообразования, открытой А.Я. Данилевским в 1996 году. Сущность работ учёного состоит в практическом доказательстве возможности синтеза белковоподобных веществ (пластеинов) под действием ферментов. Сточные воды содержат аминокислоты и пептиды, концентрация которых возрастает в результате гидролиза белковых компонентов отходов под воздействием пептидогидролаз. Данная технология уже внедрена в большинстве стран Европы, нацелена на производство в промышленных масштабах кормовых белков из аминокислот и пептидов сточных вод.

Ферменты широко используют в медицине, например в составе лечебных препаратов. Амилазу и липазу применяют при заболеваниях желудочно-кишечного тракта и печени. В последние годы эффективно применяют протеиназы в лечении злокачественных новообразований. Это объясняется бóльшей проницаемостью мембран раковых клеток для ферментов в сравнении с нормальными клетками, благодаря чему опухолевые клетки быстро лизируются при введении смеси протеиназ (препарат «папайотин»).

Фермент плазмин используют для растворения тромбов в кровеносных сосудах; коллагеназу – для рассасывания рубцовых образований; эластазу – длязадержки развития атеросклероза; лизоцим – для лечения конъюнктивитов; дезоксирибонуклеазу из стрептококка (стрептодорназа) – для лечения заболеваний верхних дыхательных путей и роговицы глаза.

Важнейшую область применения ферментов в медицине составляет диагностика, то есть тестирование патологии того или иного органа человека по уровню активности фермента или соотношению его множественных форм и изоферментов. Так, аспартатаминотрансфераза служит для выявления инфаркта миокарда; аланинаминотрансфераза – для диагностики заболеваний печени; глутамилтрансфераза – для блокировки отторжения органов при их пересадке и т. д.

Таким образом, производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к тем её отраслям, объём продукции которых постоянно растёт, а сфера применения неуклонно расширяется. По объёму производства ферментов лидируют страны Европы, но в последние годы активизировались также США и Япония.