ВЫДЕЛЕНИЕ И СТАБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

Выбор метода выделения и очистки ферментов микроорганизмов различны и определяются в зависимости от локализации (в клетках фермент или в культуральной среде) и целями применения. Неочищенные ферментные препараты получают путем сушки и размельчения мицелия гриба вместе с твердым субстратом (отрубями, жомом и др.) или высушиванием продуцента вместе с культуральной жидкостью на распылительной сушилке. Высушенные препараты размалываются в порошок и в таком виде используются. Удельная ферментная активность таких препаратов невелика, но они дешевле и достаточно устойчивы при хранении. Таким способом получают амилазы, протеазиназы, целлюлазы для сельского хозяйства и некоторых отраслей промышленности.

Получение сиропов производится при сгущении отделенной от биомассы микроорганизма культуральной жидкости, содержащей фермент.

В лабораторной практике и промышленности существуют различные способы концентрирования, однако лишь некоторые из них могут быть использованы для сгущения ферментных растворов.

При промышленном производстве ферментов наряду с активностью важными показателями являются их термоустойчивость, рН и стабильность. Следует также учитывать, что увеличения концентрации неочищенных растворов ферментов может сопровождаться повышением содержания ингибирующих примесей до критического с одновременным разложением и удалением стабилизирующих продуктов. Но обычно уменьшение содержания воды при сгущении приводит к снижению скорости химических и био­химических процессов.

Способов концентрирования известно несколько: 1) без изменения фаз (мембранные); 2) с изменением фаз (вымораживание, выпаривание). Концентрирование с помощью мембран основано на том, что состав жидкости может быть изменен при пропускании ее через мембрану с селективной проницаемостью. Идеальная мембрана должна быстро пропускать необходимое вещество из раствора, но быть барьером для всех других компонентов.

Возможен и другой вариант мембраны, при котором необходимое вещество остается, а все другие компоненты пропускаются. На практике применяют мембраны обоих типов.

Для сгущения термочувствительных жидкостей используется прием, основанный на избирательной кристаллизации воды в растворе при охлаждении ниже 0°. Сущность этого метода концентрирования заключается в том, что вода сгущаемого раствора превращается в кристаллы льда, увеличивая тем самым концентрацию растворимых веществ. Кристаллы льда удаляются центрифугированием или прессованием. Операция повторяется многократно до получения необходимой концентрации фермента. При таких условиях полностью исключаются потери термостабильных компонентов раствора (отсутствует термическое разрушение).

Разработка новых способов концентрирования биологических жидкостей не умаляет значений такого общеизвестного приема, как вакуум-выпаривание. Обилие конструкций выпарных установок и уровень современного развития исследований в этой области открывают большие возможности использования процесса выпаривания.

Физический смысл выпаривайся растворов - разделение их на две части: воду, удаляемую виде пара, и обогащенный растворимыми веществами концентрат. В ферментной промышленности широко распространен процесс концентрирования водных растворов под вакуумом. Так производят, например, сгущение водного экстракта из мицелия Asp. oryzae для получения препарата протеоризина. Большое количество ферментных препаратов производят с использованием способа вакуум-концентрирования.

Высушивание ферментных препаратов производится в вакууме при распылении или из замороженного состояния. После высушивания препарат в случай нестойкости необходимо смешивать со стабилизатором или с наполнителем (крахмал, декстрины, неорганические нейтральные соединения, тальк и др.). В некоторых случаях удается стабилизировать фермент добавлением в культуральную жидкость хелатирующих агентов. Так удалось стабилизировать щелочную протеазу Вас. subtilis добавлением в среду триполифосфата натрия, нитрилотриацетата натрия и этилендиаминтетраацетата.

Используются ферменты и в виде гомогенных белков. Получение ферментов в чистом виде осуществляется различными способами в зависимости от их свойств и области применения. Обычная схема получения экзоферментов может быть следующей:

Культуральная жидкость Обессоленный раствор

↓ центрифугирование ↓ осаждение ацетоном

Надосадочная жидкость Фильтрат

↓ диализ ↓ фракционирование ацетоном

Диализат Осадок

↓ выпаривание в вакууме ↓

I. Концентрат Водный раствор

↓ осаждение солями аммония ↓ гельфильтрация

Осадок Раствор фермента

↓ диализ ↓ высушивание в вакууме

Водный раствор III. Чистый фермент

↓ гельфильтрация

Обессоленный раствор

↓ выпаривание

II. Ферментный препарат

В промышленности высокая степень очистки ферментов не всегда нужна. Очистка должна быть очень высокой в случае использования ферментов как терапевтических препаратов.

Очистку и разделение ферментов, образующих комплексы, проводят, применяя ионообменные смолы. Ионообменный метод, например, позволяет разделить ферменты пектолитического комплекса грибов, очистить и выделить пектинэстеразы, полигалактуроназы и пектинтрасэлиминазы.

Для использования фермента как терапевтического препарата применяется иногда микрокапсулирование. Фермент, заключенный в специальные капсулы, достигает органа или ткани, где он должен проявить свою активность, там капсула растворяется и фермент попадает в тканевую жидкость

В настоящее время все шире используются так называемые иммобилизованные ферменты, т. е. ферменты, прочно связанные с различными носителями. Помимо иммобилизации высоко очищенных ферментов, весьма перспективен способ иммобилизации целых клеток микроорганизмов, обладающих той или иной ферментной активностью. В этом случае фермент более стабилен (см. гл. 10).