СИНТЕЗ ИНОЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Инозиновая кислота - метаболический предшественник важнейших пуриновых нуклеотидов - адениловой и гуаниловой кислот. Поэтому накопление инозиновой кислоты может происходить, если продуцент имеет блок в ферментных системах, осуществляющих дальнейшие ее превращения.

Очевидно, что не следует лишать структуру столь необходимых и важных метаболитов (адениловой и гуаниловой кислот). Введение их в среду для восполнения дефицита возможно, но довольно дорого. Поэтому предпочитают вводить в сферу реакции нуклеозид - инозин. Для получения 5'-инозиновой кислоты (5'-ИМФ) необходимо иметь источник фермента, фосфорилирующего инозин в 5'-положении рибозного остатка. Источниками фосфорилирующего фермента - нуклеозиддифосфаттрансферазы - могут служить многие микроорганизмы, относящиеся к родам Flavobacterium, Serratia, Staphylococcus, Pseudomonas. Донорами фосфора в этой реакции могут быть нуклеотиды, а также неприродные соединения - п-нитрофенилфосфат (п-НФФ), бензилфосфат, фенилфосфат.

В СССР в качестве источника фосфорилирующего фермента предложен штамм Pseudomonas. Культуру предварительно выращивают на среде, содержащей глюкозу, пептон, дрожжевой экстракт. В качестве ферментного препарата, осуществляющего реакцию, используют живые клетки, высушенные под вакуумом или ацетоном, а также замороженные клетки, поскольку локализация фермента внутриклеточная. Из названных выше доноров фосфата лучшим считается п-нитрофенилфосфат. Реакция происходит в ацетатном буфере, при рН 4,0, в присутствии ионов меди и цинка, заметно усиливающих выход продукта.

Наиболее важными факторами, определяющими активность реакции фосфорилирования инозина, являются концентрации донора (фосфора), акцептора (инозина) и количества клеток. При оптимальных соотношениях п-НФФ и инозина клетки Ps. trifolii могут фосфорилировать до 90% инозина в реакционной смеси. Выход инозиновой кислоты можно увеличить, если к реакционной смеси добавить поверхностно-активные вещества, в частности различные твины. Концентрации добавок подбирают опытным путем.

Как и во всех других случаях использования в качестве ферментных препаратов клеток микроорганизмов, возникает необходимость оценить активность и условия ее проявления у ферментов, разрушающих целевой продукт синтеза. Наиболее нежелательно для синтеза инозиновой кислоты наличие активных фосфомоноэстеразы и 5'-нуклеотидазы. Если невозможно подавить их активность ингибиторами, то следует выбрать условия, при которых она будет минимальной. В первую очередь к условиям, наиболее легко регулируемым, относятся температура и рН среды. Инозиновую кислоту выделяют в виде бариевой соли и путем ионообменной хроматографии.