ПОЛУЧЕНИЕ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

Лимонная кислота - трехосновная кислота, широко распространенная в плодах и ягодах. Она широко применяется в пищевой промышленности при производстве кондитерских изделий и напитков, в фармацевтической, химической и текстильной промышленности. Лимонная кислота была идентифицирована в качестве продукта метаболизма плесневых грибов в 1893 г. Вемером. В настоящее время это кислота по объемам производства (свыше 350 тыс. т/г) занимает первое место среди всех органических кислот.

У микроорганизмов синтез лимонной кислоты реализуется в цикле дикарбоновых кислот и осуществляется в результате конденсации кислоты с четырьмя атомами углерода и двумя карбоксильными группами и кислоты с одной карбоксильной группой. Образуемая в результате гликолиза пировиноградная кислота связывается с углекислотой; синтезируемая при этом щавелевоуксусная кислота реагирует с уксусной кислотой с образованием лимонной кислоты, то есть образование лимонной кислоты включает реакции гликолиза и ряд реакций цикла Кребса. При каждом обороте цикла молекула щавелевоуксусной кислоты взаимодействует с уксусной, образуя лимонную кислоту.

Производство лимонной кислоты методом ферментации плесневых грибов принадлежит к числу давних биотехнологических процессов. Первое производство было реализовано в конце XIX века. Совершенствование процесса получения лимонной кислоты тесно связано с разработкой многих фундаментальных аспектов микробиологии (борьбой с микробным загрязнением производственной культуры, оптимизацией состава питательных сред, селекцией высокопродуктивных штаммов и др.).

В промышленном производстве лимонной кислоты в качестве продуцента в основном используют Aspergillus niger, но также применяют и A. wentii. Процесс ферментации достаточно сложен, так как лимонная кислота, является продуктом первичного метаболизма грибов, и даже незначительное выделение данного продукта в окружающую среду свидетельствует о выраженном дисбалансе клеточного метаболизма. Рост продуцента и синтез кислоты обычно регулируют составом среды (сахара, P, Mn, Fe, Zn). Сверхсинтез лимонной кислоты реализуется при больших концентрациях сахаров в среде (14 – 24 %) и является ответной реакцией продуцента на дефицит фосфора, а также других металлов, хотя их роль до конца не ясна. Это, видимо, и подавление анаболизма, и влияние на свойства поверхности и морфологию гиф.

Оптимум рН на стадии кислотообразования составляет 1,7 – 2,0. В более щелочной среде процесс сдвигается в сторону накопления щавелевой и глюконовой кислот. В качестве основы среды обычно используют глюкозный сироп, гидролизаты крахмала или мелассу. Последнюю предварительно разбавляют до требуемого уровня сахаров и обрабатывают с целью снижения содержания металлов. Источником азота служат соли аммония (0,2%); концентрация фосфатов (0,01 – 0,2%). В качестве пеногасителей используют природные масла с высоким содержанием жирных кислот. Очень существенное значение имеет уровень аэрации культуры.

В производстве лимонной кислоты применяют несколько вариантов процесса. Поверхностный способ реализуется на твердой сыпучей среде и в жидкой фазе. При жидкофазной поверхностной ферментации питательную среду разливают в кюветы слоем от 8 до 18 см. Кюветы размещают на стеллажах в предварительно простерилизованной парами формалина бродильной камере. Через специальные воздуховоды с током стерильного воздуха поверхность среды засевают исходной музейной культурой. В качестве посевного материала используют предварительно полученные также в условиях поверхностной культуры и высушенные споры (конидии) из расчета 50 – 75 мг конидий на 1 м² площади кювет. Известно несколько вариантов процесса: бессменный, бессменный с доливами и метод пленок.

При бессменном режиме процесс осуществляется на одной среде от момента засева спор до завершения стадии кислотообразования. При использовании метода пленок через 7 суток после завершения кислотообразования сброженный раствор мелассы сливают из кювет, мицелий промывают стерильной водой и в кюветы заливают новую среду. Бессменный способ с доливом характеризуется дробными добавками мелассы под пленку гриба на стадии кислотообразования (30 – 35% от исходного объема), так называемый режим с подпиткой субстратом. Это позволяет повысить выход лимонной кислоты на 15 – 20% с единицы поверхности при сокращении затрат сахаров на 10 – 15% по сравнению с другими методами. В ходе стадии ферментации на первом этапе (первые 24 – 36 ч) происходит интенсивный рост мицелия. Температура среды в этот период стабилизируется на уровне 32 – 34°C, интенсивность аэрации составляет 3 – 4 м³ воздуха в ч/м мицелия. В период активного кислотообразования подачу воздуха увеличивают в 5 – 6 раз. В результате более интенсивного термогенеза температуру снижают до 30 – 32°С. По мере снижения процесса кислотообразования режим аэрации становится менее интенсивным. Контроль процесса ведут по показателям титруемой кислотности среды. Процесс считают завершенным при остаточной концентрации сахаров около 1 – 2% и уровне титруемой кислотности 12 – 20%. Содержание лимонной кислоты от уровня всех кислот достигает 94 – 98%. Сброженный раствор сливают в сборник и направляют на обработку; промытый мицелий используют в кормопроизводстве.

Твердофазная ферментация имеет много общего с поверхностно-жидкофазным процессом. Разработанный в Японии процесс Коджи предусматривает использование в качестве среды пористого материла (багасса, картофель, пульпа сахарной свеклы, пшеничные отруби). Материал предварительно стерилизуют, после охлаждения инокулируют суспензией спор. Ферментация происходит в лотках при 25 – 30°C в течение 6 – 7 дней. Образованную лимонную кислоту экстрагируют водой.

В 60-е годы начали разрабатывать процессы получения лимонной кислоты на основе жидких углеводородов (С₉ – С₃₀) с использованием в качестве продуцентов дрожжей (Candida) и бактерий (Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter), а также с применением метода проточных культур.

Готовый продукт - высокоочищенную кристаллическую лимонную кислоту получают в ходе постферментационной стадии. В сброженных растворах содержатся, помимо целевой кислоты, также глюконовая и щавелевая кислоты, остатки несброженных сахаров и минеральные соли. Для выделения лимонной кислоты из данного раствора ее связывают гидроокисью кальция с образованием трудно растворимого цитрата кальция:

2С₆Н₈О₇ + 3Са(ОН)₂ = Са₃(С₆Н₅О₇)₂ + 6Н₂О.

Одновременно образуются кальциевые соли глюконовой и щавелевой кислот, глюконат кальция Сa(С₆Н₁₁О₇)­₂ и оксалат кальция СаС₂О₄. Кальциевые соли лимонной и щавелевой кислот выпадают в осадок, а глюконат кальция и основная часть органических и минеральных компонентов мелассы остаются в растворе. Осадок отделяется на вакуум-фильтре, промывается и высушивается. Далее для перевода лимонной кислоты в свободное состояние и освобождения от оксалата кальция осадок обрабатывают серной кислотой с последующей фильтрацией. Раствор лимонной кислоты фильтруют, концентрируют вакуумной выпаркой и затем подвергают кристаллизации при медленном охлаждении до 8 – 10°С. Полученные кристаллы отделяют в центрифуге от маточника и высушивают в пневматических сушилках при 30 – 35°С. Готовый продукт содержит не менее 99,5% лимонной кислоты (в пересчете на моногидрат), зольность - не выше 0,1 – 0,35%.