Идентификация гибридных клеточных линий, секретирующих специфические антитела

Теперь необходимо идентифицировать гибрид­ные клетки, вырабатывающие специфические антитела к им­мунизирующему антигену. Для этого обычно проводят скрининг культуральных сред, содер­жащих секретирующие антитела гибридомные клетки. Среду из тех лунок, в которых есть такие растущие клетки, отбира­ют и переносят в лунки другой микротитровальной плашки, предварительно покрытые слоем молекул антигена-мишени. Если в культуральной среде находится антитело (первое антите­ло), распознающее один из эпитопов данного антигена, то оно свяжется с антигеном и оста­нется в лунках после их промывания. Затем в лунки добавляют второе антитело, специфич­ное к мышиным антителам. Оно будет присое­диняться к любому первому антителу, связан­ному с антигеном.

К используемому в иммунном анализе второ­му антителу предварительно присоединяют фермент, который превращает неокрашенный субстрат в окрашенное соединение. Изменение цвета содержимого одной из лунок говорит о том, что исходная культуральная среда содержа­ла антитело, специфичное к данному антигену (рис.2). Если же такое антитело в среде отсут­ствовало, то второму антителу не с чем будет связываться и оно смоется при втором промывании. Субстрат в таких лунках остается неокрашенным.

Лунки исходной микротитровальной плашки, среда из которых дает положительный иммунный ответ (изменение цвета), могут содержать смесь гибридом различного типа. Чтобы получить линии, происходящие от одной клетки (клоны), клеточную суспензию из таких лунок сильно разбавляют культуральной средой и высевают в другие лунки. После культивирования полученных клонов среды вновь тестируют, определяя, какая из клеточных линий (гибридом) продуцирует моноклональные антитела, распознающие анти­ген-мишень. В том случае, когда получают более одной специфичной гибридомы, проводят даль­нейшие исследования, позволяющие опреде­лить, направлены ли антитела, вырабатываемые разными клонами, против одной и той же анти­генной детерминанты. Каждый клон, продуци­рующий моноклональное антитело, можно под­держивать в культуре практически бесконечно. Кроме того, образцы можно заморозить в жид­ком азоте и использовать их в дальнейшем как источник клеток.

Гибридомы, подобно большинству других кле­точных культур животных, растут относительно медленно, не достигают высокой плотности и требуют сложных и дорогих сред. Получаемые таким образом моноклональные антитела

очень дороги, что не позволяет широко использовать их в клинике для создания иммунных сывороток или лекарственных препаратов. Чтобы решить эту проблему, предпринимаются попытки получения моноклональных антител на основе генетически модифи­цированных бактерий, растений и животных и прежде всего Е. coli.