МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ

Белки под действием различных факторов (действие химических реагентов, нагревание и др.) легко подвергаются денатурации - теряют некоторые нативные (природные) свойства, например, растворимость, биологическую активность. Поэтому для выделения белков разработаны специальные «щадящие» методы.

Процесс начинают с гомогенизациибиологического материала – измельчения до разрушения клеточных структур. Для этого используют пестиковые или ножевых гомогенизаторы, шаровые мельницы, ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, метод «азотной бомбы».

Затем проводят экстракцию белков буферными смесями с определенными значениями рН, органическими растворителями. Большинство белков хорошо растворимо в 8-10% растворах солей.

Для фракционированияи очистки белков используют следующие методы.

Высаливание – осаждение белков из раствора при добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов. Этот метод используется в клинической практике при анализе белков сыворотки крови, например, для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении раствора сульфата аммония) и альбуминов (при 100% насыщении).

Электрофорез основан на различии в скорости движения белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора. Применяется в клинической медицине для анализа белковых и пептидных смесей, сыворотки крови.

Ультрацентрифугирование - метод разделения жидких дисперсных сред на компоненты под действием центробежной силы.

Хроматография (от греч. chroma – цвет) - физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами – неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент).

Различают следующие разновидности хроматографии:

- адсорбционная- разделение компонентов смеси основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте;

- распределительная - твердая фаза служит опорой для стационарной жидкой фазы. Разновидностью является хроматография на бумаге;

- ионообменная - используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются с колонки;

- гель-хроматография, или метод молекулярных сит, основан на способности небольших молекул проникать в поры геля, тогда как большие молекулы остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки. Позволяет разделить белки с разной молекулярной массой.

Перспективными видами хроматографииявляются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газовая хроматография. Хроматография является одним из основных методов биохимических исследований. В клинических лабораториях ее применяют для разделения и анализа аминокислот, белков, углеводов, фосфолипидов, стероидов в плазме крови, тканевых экстрактах, моче.

ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

Каталитическая функция. Большинство известных в настоящее время ферментов, называемых биологическими катализаторами, является белками. К настоящему времени охарактеризованы несколько тысяч ферментов.

Транспортная функция. Дыхательная функция крови, в частности перенос кислорода, осуществляется молекулами гемоглобина-белка эритроцитов. В транспорте липидов принимают участие альбумины сыворотки крови.

Защитная функция. В ответ на поступление в организм бактерий, токсинов, вирусов или чужеродных белков синтезируются защитные белков-антител (иммунная защита). Ряд белков плазмы крови способны к свертыванию, что предохраняет от кровопотери при ранениях (физическая защита).

Гормональная функция. Ряд гормонов представлен белками или полипептидами, например, гормон поджелудочной железы инсулин.

Структурная функция. В комплексе с липидами белки участвуют в образовании биомембран клеток. Структурные белки цитоскелета придают форму клеткам и многим органоидам. Структурные белки - коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, коже, эластин в сосудистой стенке и др.

Питательная (резервная) функция. Белки яйца (овальбумины) являющиеся источниками питания для плода. Основной белок молока (казеин) также выполняет питательную функцию.

Рецепторная функция. Белковые рецепторы встраиваются в клеточную мембрану или находятся в цитоплазме. Рецептор воспринимает сигнал, которым чаще всего служит химическое вещество.

Сократительная (двигательная) функция.Сократительная функция присуща мышечным белкам (актин и миозин), белкам цитоскелета, что обеспечивает расхождение хромосом в процессе митоза.

Другие важные функции белков - способность поддерживать онкотическое давление в клетках и крови, буферные свойства, поддерживающие физиологическое значение рН внутренней среды, и др.