Нуклеотидный состав и структура ДНК и РНК.

Нуклеотидный состав, т.е. набор и соотношение нуклеотидных компонентов, служит очень важной характеристикой нуклеиновых кислот. Один из основных путей установления состава нуклеиновых кислот основан на исследовании продуктов их гидролитического расщепления. Поскольку межнуклеотидные связи в полинуклеотидах являются сложноэфирными, то полинуклеотидные цепи способны гидролизоваться как в кислой, так и щелочной среде.

Химический гидролиз ДНК почти не используется из-за осложнения его побочными процессами. Более предпочтителен ферментативный гидролиз ДНК под действием нуклеаз. Обычно для этой цели используют змеиный яд, в котором содержатся ферменты, расщепляющие сложноэфирную связь с фосфорной кислотой (фосфодиэстеразы и фосфомоноэстеразы). Нуклеазы проявляют специфичность по отношению к типу нуклеиновых кислот; их делят на рибонуклеазы и дезоксирибонуклезы.

Выделение и идентификацию компонентов нуклеиновых кислот производят с помощью физико-химических методов. Очень важную роль в разделении сложных смесей играют хроматографические методы. Пиримидиновые и пуриновые основания, обладающие вследствие ароматического характера заметным поглощением около 260 нм, обычно идентифицируют с помощью УФ-спектроскопии. Поскольку нуклеотиды имеют кислотный характер и способны находиться в ионизированном состоянии, то для их идентификации используют также электрофорез.

Наряду с определением нуклеотидного состава важнейшая задача состоит и в установлении нуклеотидной последовательности, т.е. порядка чередования нуклеотидных звеньев. Общий подход заключается в использовании блочного метода: сначала полинуклеотидную цепь направленно расщепляют на более мелкие блоки – олигомеры и определяют в них нуклеотидную последовательность. Такой анализ повторяют дважды, используя во второй раз такие расщепляющие агенты, которые делят цель на фрагменты в иных местах по сравнению с первым разом. Полинуклеотидную цепь расщепляют на довольно короткие фрагменты. Более длинные олигонуклеотиды пока еще трудно поддаются изучению.

Первичная структура нуклеиновых кислот определяется природой и последовательностью нуклеотидных звеньев, связанных сложноэфирными связями между пентозами и фосфатными группами (рис 13).

Рис. 13. Первичная структура участка цепи нуклеиновых кислот

В составе молекулы ДНК выделено значительно большее число нуклеотидных остатков, чем в молекуле РНК. Молекулярная мас­са ДНК порядка 10 млн; ДНК в условиях клетки нерастворима. Длина молекул ДНК человека состав­ляет примерно 3 — 5 см; молекула РНК значительно короче — менее 0,01 см.

Вторичная структура нуклеиновых кислот. Согласно вторичной структуре полинуклеотидная цепь ДНК представляет собой двойную спираль, в которой пуриновые и пиримидиновые основания направлены внутрь. Между пуриновым основаниями одной цепи и пиримидиновым основанием другой цепи имеются водородные связи, стабилизирующие такую структуру. Основания, образующие пары, связанные водородными связями,называются комплементарными. В ДНК комплементарными будут: аденин – тимин, образующие между собой две водородные связи, и гуанин – цитозин, связанные тремя водородными связями (рис 14). Это означает, что пуриновым основаниям аденину и гуанину в одной цепи будут соответствовать пиримидиновые основания тимин и цитозин в другой цепи. Полинуклеотидные цепи, образующие двойную спираль, не идентичны, но комплементарны между собой.

а б

Рис. 14. Водородные связи в паре оснований гуанин -цитозин (а), аденин – тимин (б)

Макромолекулы ДНК связаны между собой попарно при помощи водородных связей в виде двойной спирали постоян­ного диаметра (рис. 15). Остатки нуклеи­новых оснований направлены внутрь спи­рали, диаметр которой равен примерно 2 нм.

На один виток спирали приходится 10 пар оснований. Для обеспечения наи­большей устойчивости этой структуры во­дородных связей должно быть максималь­но много. Только при выполнении это­го условия обеспечивается экспериментально доказанное постоянство суммарных размеров боковых групп и неизменность диаметра двойной спирали на всем ее протяже­нии. В этой взаимной обусловленности последовательности звень­ев в обеих цепях заключается принцип комплементарности.

Комплементарность цепей и последовательность звеньев со­ставляют химическую основу важнейших функций нуклеиновых кислот: ДНК — хранение и передача наследственной информа­ции, а РНК — непосредственное участие в биосинтезе белка. Мо­лекулярная масса ДНК варьирует от нескольких миллионов до десятка миллиардов, у РНК - от десятка тысяч до нескольких миллионов.

Комплементарность оснований лежит в основе закономерностей, сформулированных Э. Чаргаффом, которым подчиняется нуклеотидный состав ДНК различного происхождения.

Правила Чаргаффа:

1) количество пуриновых оснований равно количеству пиримидиновых оснований, т.е. (А+Г)=(Ц+Т).

2) Количество аденина равно количеству тимина (А=Т); аналогично количество гуанина равно количеству цитозина (Г=Ц).

3) Количество оснований, содержащих аминогруппу в положении 4 пиримидинового и положении 6 пуринового ядра, равно количеству оснований, содержащих в этих же положениях оксогруппу. Это означает, что А+Ц=Г+Т.

Для РНК правила Чаргаффа либо не выполняются, либо выполняются с некоторым приближением. Это обусловлено тем, что в составе РНК содержится много минорных оснований.

Сравнение макромолекулы ДНК с винтовой лестницей наводит на мысль об ее хиральности. Действительно, природные ДНК обладают оптической активностью. В то же время смеси нуклеотидов, составляющих ДНК, а также разупорядоченные полинуклеотические цепи оптически неактивны. Это свидетельствует о том, что оптическая активность природных ДНК связана с хиральностью их вторичной структуры.

Каркас спирали образован чередующимися углеводными и фосфатными остатками. Окружающая водная среда контактирует с гидрофильной частью спирали, а внутренняя часть спирали (основания) с водой не контактирует.

Молекула ДНК, в отличие от молекулы РНК, в большинстве случаев состоит из двух комплементарных взаимозакрученных цепей. В зависимости от длины витка и угла спирали, а также ряда других ее геометрических параметров, различают, более де­сяти разнообразных упорядоченных спиральных структур ДНК. В стабилизации этих структур наряду с водородными связями, действующими поперек спирали, большую роль играют межмо­лекулярные взаимодействия, направленные вдоль спирали между соседними пространственно сближенными азотистыми основа­ниями. Поскольку эти взаимодействия направлены вдоль стоп­ки азотистых оснований молекулы ДНК, их называют стэкинг-взаимодействиями. Таким образом, взаимодействия азотистых оснований между собой скрепляют двойную спираль молекулы ДНК и вдоль, и поперек ее оси.

Сильное стэкинг-взаимодействие всегда усиливает водород­ные связи между основаниями, способствуя уплотнению спира­ли. Вследствие этого молекулы воды из окружающего раствора связываются в основном с пентозофосфатным остовом ДНК, по­лярные группы которого находятся на поверхности спирали. При ослаблении стэкинг-взаимодействия молекулы воды, про­никая внутрь спирали, конкурентно взаимодействуют с поляр­ными группами оснований, инициируют дестабилизацию и спо­собствуют дальнейшему распаду двойной спирали. Все это сви­детельствует о динамичности вторичной структуры ДНК под воздействием компонентов окружающего раствора. Двойная спираль характерна для большинства молекул ДНК. Однако ДНК может иметь и другие формы. В некоторых вирусах содержится одноцепочечная ДНК, встречаются также кольцевые формы.

Биспиральные структуры в молекулах РНК возникают в пре­делах одной и той же цепи в тех зонах, где расположены комплементарные азотистые основания аденин - урацил и гуанин - цитозин (рис. 16). В результате вторичная структура молеку­лы РНК содержит биспиральные участки и петли, число и раз­меры которых определяются первичной структурой молекулы и составом окружающего раствора.

Рис. 16. Вторичная структура молекулы РНК

Третичная структура нуклеиновых кислот. Двойная спираль молекул ДНК существует в виде линейной, кольцевой, суперкольцевой и компактных клубковых форм. Между этими формами совершаются взаимные переходы при действии особой группы ферментов – топоизомераз, изменяющих пространственную структуру (рис 17).

Рис. 17. Третичная структура молекулы ДНК:

а -линейная, б - кольцевая, в - суперкольцевая, г - компактный клубок

Третичная структура многих молекул РНК пока еще требует окончательного выяснения, но уже установлено, что она зависит не только от первичной и вторичной структуры, но и от состава окружающего раствора.