Цитоплазматическая наследственность

Наряду с ядерными генами, локализованными в хромосо­мах, обнаружены факторы наследственности, находящиеся в цитоплазме. Их называют плазмагенами (плазмидами). Хими­ческую основу плазмагенов составляют молекулы ДНК; ДНК содержат пластиды, митохондрии и некоторые другие органо­иды. В цитоплазме могут находиться также чужеродная ДНК вирусов и плазмиды бактерий. Внеядерная ДНК способна реплицироваться независимо от репликации хромосом, но под контролем ядерных генов. Цитоплазматическое наследо­вание идет по материнской линии, т. е. через цитоплазму яйцеклетки, так как сперматозоид почти не содержит ее. Воз­можными критериями цитоплазматической наследственно­стиявляются:

▪ отсутствие количественного менделевского расщепле­ния в потомстве;

▪ невозможность выявления сцепления;

▪ различие результатов реципрокных скрещиваний.

Выделяют следующие основные виды цитоплазматиче­ской наследственности: пластидную, митохондриальную и псевдоцитоплазматичес-

кую.

Открытие пластидной наследственности при­надлежит К. Корренсу (1908), описавшему пестролистность у растения "ночная красавица". У пестролистных растений часть пластид неспособна образовывать хлорофилл. Пластиды при митозе распределяются между дочерними клетками неравномерно. Часть клеток получает только нормальные пластиды (листья будут зеленые), часть — только аномальные (листья будут белые, растение без хлорофилла погибнет) и часть — нормальные и аномальные пластиды (листья будут пестрые — зеленые с белыми пятнами) (рис. 3.20).

Рис. 3.20. Схема распределения пластид, содержащих и не содер­жащих хлорофилл,

при делении клетки

Митохондриальная наследственность опи­сана Б. Эфрусси (1949). Он обнаружил, что около 1% хлебных дрожжей дают карликовые колонии. Оказалось, что клетки карликовых колоний не имеют в митохондриях дыхательных ферментов вследствие мутации плазмагенов и поэтому растут очень медленно. Гены, кодирующие дыхательные ферменты, находятся в кольцевых молекулах ДНК митохондрий. Длина каждой такой молекулы — примерно 15 000 пар нуклеотидов. Расчеты показали, что объем собственной наследственной информации митохондрий недостаточен для воспроизведе­ния всей совокупности РНК и белков органоида. Многие бел­ки включаются в структуру митохондрий, будучи запрограм­мированными ядерными генами.

Генóм митохондрий человека представлен кольцевой мо­лекулой ДНК, содержащей 16 569 пар нуклеотидов. В состав генома входят гены р-РНК, 22 различных т-РНК, субъединиц I, II и III оксидазы цитохрома с, субъединиц 6-АТФазы, цито-хрома b и 9 других пока не известных белков. ДНК митохонд­рий имеет очень мало некодирующих участков; транскрибируются обе ее цепочки. Имеются данные о том, что некоторые наследственные болезни человека обусловлены мутациями митохондриальных генов (митохондриальная цитопатия, бо­лезнь Лебера, синдром Альморга и др.).

В цитоплазме бактерий обнаружены автономно располо­женные плазмиды, состоящие из кольцевых молекул двухцепочечной ДНК. Они обусловливают устойчивость бактерий к лекарствам (антибиотикам), программируют синтез некото­рых ядов (гемолизин, энтеротоксин). Плазмиды обеспечива­ют также обмен генетической информацией между микроор­ганизмами. Внехромосомные молекулы ДНК широко используются в генной инженерии, так как они способны включать генетический материал хромосом и переносить его в другие клетки.

Псевдоцитоплазматическая наследствен­ность обусловлена попаданием в цитоплазму клеток участ­ков чужеродной ДНК, т. е. своего рода внутриклеточным па­разитизмом. Так, у некоторых линий мух дрозофил имеется повышенная чувствительность к углекислому газу. Установ­лено, что эта особенность обусловлена передачей через цито­плазму яйца особых вирусов.

У мышей описаны линии с "наследственной" предраспо­ложенностью к развитию рака молочной железы. При деталь­ном изучении этого явления оказалось, что предрасположен­ность передается не через половые клетки, а через молоко, в котором содержится вирус (фактор молока). Если новорож­денных мышат "раковой" линии вскармливает самка "нор­мальной" линии, они остаются здоровыми. Если же мышат "нормальной" линии вскармливает самка "раковой" линии, то у последних развивается рак молочной железы.

Генная инженерия

На основании достижений молекулярной биологии, био­химии и генетики в последние десятилетия интенсивно раз­вивается новое направление — генная инженерия, целью кото­рой является конструирование генетических структур по заранее намеченному плану, создание организмов с новой ге­нетической программой путем переноса генетической ин­формации из одного организма в другой.

Методы генной инженерии были разработаны в 60-70-х годах прошлого столетия. Они включают следующие основ­ные этапы:

▪ получение генетического материала;

▪ включение этого материала в автономно реплицирую­щуюся генетическую структуру (векторную молекулу) и со­здание рекомбинантной ДНК;

▪ введение рекомбинантных молекул ДНК в клетку-реци­пиент и включение ее в хромосомный аппарат;

▪ отбор трансформированных клеток, в геном которых вклю­чен переносимый ген.

В настоящее время применяют несколько способов полу­чения генов для пересадки. Если полностью расшифрована последовательность нуклеотидов, то ген может быть синте­зирован химическим путем. Впервые искусствен­ный ген аланиновой т-РНК, состоящий из 77 пар нуклеоти­дов, был синтезирован индийским ученым Г. Корана (1970). В 1976 г. был синтезирован ген тирозиновой т-РНК, состоя­щий из структурной и регуляторной частей (промотор и терми­натор), который при введении в бактериальную клетку нор­мально функционировал. Однако химическим способом удает­ся синтезировать только небольшие по размеру гены прокариот.

Синтез сложных генов осуществляют с помощью процес­сов обратной транскрипции, в основе которых лежит метод ферментативного синтеза. Выделяют и-РНК, и на ней, как на матрице, с помощью фермента ревертазы синте­зируют комплементарную ей нить ДНК, которую затем реп­лицируют (фермент ДНК-полимераза). Гены, синтезирован­ные с помощью ревертазы, не имеют регуляторной части и промотора и вследствие этого не могут функционировать в животных клетках. При переносе в бактерию к структурным генам присоединяют промотор микробной клетки, после чего транскриптон начинает работать.

Выделять необходимые для пересадки гены можно с помощью ферментов рестриктаз. В 1974 г. были от­крыты ферменты рестриктазы, способные узнавать опреде­ленные последовательности нуклеотидов и делать симмет­ричные, расположенные наискось друг от друга разрывы в цепях ДНК на равных расстояниях от центра узнавания. В ре­зультате на концах каждого фрагмента расщепленной ДНК образуются короткие одноцепочечные участки, называемые "липкими концами" (рис. 3.21).

Рис. 3.21. Схема действия ре­стриктаз

К настоящему времени выделено свыше 200 различных рестриктаз, разрывающих молекулы ДНК с разной последовательностью нук­леотидов. Используя различные рестриктазы, удается выделять необходимые для пересадки гены.

Полученные различными спо­собами гены соединяются с вектор­ными молекулами, которыми могут служить плазмиды бактерий, липосомы, фаги и вирусы. Фаги и виру­сы передают генетическую инфор­мацию посредством трансдукции. Кольцевая молекула ДНК плазмиды разрывается той же рестриктазой, что и выделяемый ген. В области разрыва образуются "липкие концы", комплемен­тарные "липким концам" пересаживаемого гена. Фермент лигаза сшивает "липкие концы" гена и плазмиды. Получается рекомби-нантная молекула ДНК, которая обладает способностью прони­кать в клетку-реципиент. Комбинируя различные рестриктазы и лигазы, можно разрезать нить ДНК в разных местах и получать рекомбинантные молекулы (рис. 3.22).

Рис. 3.22. Схема встраивания гена в плазмиду и введения

рекомбинант­ной плазмиды в бактерию

Так как рекомбинированные молекулы ДНК попадают не во все клетки, то с помощью специальных методов (чаще все­го на селективных питательных средах) осуществляют отбор трансформированных клеток (с перенесенным геном). В дальнейшем проводят клонирование — размножение клеток с рекомбинантной ДНК — и получают клон клеток с заданны­ми свойствами.

Объединение чужеродных генов в одной клетке чревато опас­ными последствиями. Плазмиды способны соединяться в любых комбинациях независимо от видовых и иммунологических барь­еров. Конструирование новых разновидностей болезнетворных бактерий, устойчивых к лекарственным препаратам, может при­вести к возникновению серьезных эпидемий. В 1973 г. была про­ведена первая международная конференция по предупреждению опасных последствий генной инженерии. Опыты на время были запрещены. В 1975 г. Р. Кертис получил мутант кишечной палоч­ки, нежизнеспособный в естественных условиях в связи с нару­шением синтеза оболочки. Безопасная для человека и животных бактерия может жить только в лабораторных условиях. Это поз­волило возобновить опыты по генной инженерии. Такие иссле­дования проводятся в специальных строго изолированных лабо­раториях с обязательным соблюдением определенных мер безо­пасности.

Дальнейшее развитие генной инженерии базируется на следующих достижениях молекулярной биологии:

▪ возможность вызывать с помощью химических мутагенов специфичес-

кие мутации в определенных генных локусах;

▪ возможность передавать генетическую информацию у эукариот неполо-

вым путем (трансформация или трансдукция), что позволит проводить генную терапию соматических заболеваний;

▪ возможность заменять дефектные гены, используя в качестве перенос-

чиков вирусы, липосомы и др.;

▪ возможность включать в геном человека искусственно син­тезированные гены.

Генная инженерия — интенсивно развивающееся и пер­спективное направление генетики. Методами генной инже­нерии в промышленных масштабах уже получены клоны клеток кишечной палочки, способные продуцировать соматотропин, инсулин, интерферон и др. Обычно эти препараты получают из соответствующих тканей животных. Преимуще­ство препаратов, полученных методами генной инженерии, заключается в возможности их синтеза в достаточных количе­ствах, в биохимической чистоте и абсолютной стерильности.

Уже созданы растения, способные усваивать атмосферный азот, микроорганизмы, разрушающие углеводороды нефти и синтезирующие из них пищевые белки. Разработаны методы внесения генов патогенных вирусов в бактериальные клетки и приготовления из синтезированных ими белков противовирус­ных сывороток; проходят клинические испытания методы лече­ния некоторых опухолей (например, рака молочной железы), иммунодефицитных состояний и энзимопатий. В будущем генная инженерия поможет человечеству избавиться от ряда наследст­венных заболеваний путем пересадки зародышу недостающих ге­нов или замены мутантных генов.

В настоящее время создаются банки генов человека, некото­рых животных и растений.

Подробнее рассмотрим перспективы генной те­рапии человека. К концу 2001 г. в мире было утвержде­но свыше 400 генно-терапевтических проектов клинических испытаний методов лечения многих заболеваний человека.

Необходимо различать две разные цели генной терапии — коррекцию генетических дефектов в соматических клетках и коррекцию в зародышевых клетках или на самых ранних ста­диях развития зиготы.

В настоящее время для переноса генов можно использо­вать клетки костного мозга, фибробласты и зародышевые клетки человека. Эти клетки можно извлечь из организма, культивировать, перенести в них нужный ген и снова ввести пациенту, в организме которого они будут размножаться. Наи­более перспективным является перенос нужных генов, связанный с использованием ретровирусов. Для того чтобы при­менять на практике генную инженерию, необходимо быть уверенным в ее безопасности. Например, человеческие про-тоонкогены по структуре отчасти сходны с нуклеиновой кис­лотой ретровирусов и при заражении ими клеток возможна модификация протоонкогенов и превращение их в онкогены.

В экспериментах на мышах проведена генная терапия на уровне зародышевых клеток: в оплодотворенные яйцеклетки мышей карликовой линии вводили гены гормона роста крыс. При этом только часть потомков (6 из 41) достигли ги­гантских размеров. Очевидно, что большинство введенных генов не подвергались нормальной регуляции, так как не удавалось внедрять их в места обычной локализации в хро­мосоме. Встраивание происходило в случайном порядке и в некоторых случаях это вызывало у мышей-реципиентов серьезные нарушения работы нормальных генов или их му­тации в участках встраивания. По мнению большинства ме­дицинских генетиков, метод генной терапии не следует в обозримом будущем применять к оплодотворенным клеткам человека, так как опасность изменения его генетической конституции слишком велика. По рекомендациям Всемир­ной организации здравоохранения ЮНЕСКО и Совета Ев­ропы временно приостановлено проведение экспериментов и клинических испытаний по трансгенозу зародышевых кле­ток человека.