Приготовление препарата фиксированных (убитых) клеток

Фиксированные окрашенные препараты используют для выявления морфологических особенностей, количественного учета микроорганизмов, а также для проверки чистоты культуры. Фиксированные окрашенные препараты рассматривают с иммерсионным объективом. Приготовление фиксированного окрашенного препарата включает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание мазка, его фиксацию и окраску.

Приготовление мазка. На обезжиренное предметное стекло помещают маленькую капельку воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала, как для препарата «раздавленная капля». Получившуюся суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1-2 см² возможно более тонким слоем. Мазок должен быть на столько тонким, чтобы высыхал тотчас же после приготовления.

Высушивание мазка. Лучше всего сушить препарат при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает очень быстро. Если высушивание мазка замедлено, то препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить крайне осторожно, не перегревая мазка, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Фиксация. Фиксация препарата преследует несколько целей:

- убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними;

- обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу;

- сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки лучше окрашиваются, чем живые.

Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат обычно трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок. Так как при этом происходить грубое изменение клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например, их сморщивание.

Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают простые и дифференциальные способы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальная окраска предполагает окрашивание не всей клетки, а определенных ее структур. С помощью дифференциальной окраски выявляют некоторые клеточные структуры, запасные вещества и включения. Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, лежащие над кюветой, и заливают красителем на 1-3 минуты. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя на мазке не подсыхал. В случае необходимости на мазок наливают новые порции красителя. По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой, помещают на окрашенный мазок каплю иммерсионного масла и просматривают с объективом 90х. Последовательность приготовления препарата «фиксированных клеток» представлена на рис. 3.5. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет вместо использования растворов красителя применять фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителем. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов. Фиксированные окрашенные препараты могут храниться длительное время.

Рис. 3.5 - Последовательность приготовления препарата «фиксированных клеток»

УРОВНИ САПРОБНОСТИ. Биологическая индикация природных водоемов

Полисапробная зона (р)характеризуется большим содержанием нестойких органических веществ и наличием продуктов их анаэробного распада. В воде в изобилии присутствуют белковые вещества. БПК (биологическое потребление кислорода) составляет десятки миллиграммов на литр. Фотосинтез отсутствует. Кислород может поступать в воду только за счет атмосферной реаэрации, и так как он полностью потребляется на окисление в поверхностных слоях, то в воде он практически не обнаруживается. Вода содержит метан и сероводород.

Таблица 4.1 - Уровни сапробности и трофности вод

Для этой зоны характерно наличие большого числа сапрофитной микрофлоры, представленной сотнями тысяч и даже миллионами клеток в 1 мл. В донных отложениях кислород отсутствует, содержится много органического детрита, протекают восстановительные процессы, железо находится в форме FeS. Ил имеет черную окраску с запахом сероводорода. В этой зоне в массе развиваются растительные организмы с гетеротрофным типом питания: сапрофитные бактерии, нитчатые бактерии, серные бактерии, из простейших – инфузории, бесцветные жгутиковые (рис. 4.1).

Альфа-мезосапробная зона (α – т). В этой зоне начинается аэробный распад органических веществ с образованием аммиака, содержится много свободной углекислоты, кислород присутствует в малых количествах. Метан и сероводород отсутствуют. Количество загрязнения, определяемого по БПК, все еще очень велико: десятки миллиграммов на литр. Количество сапрофитных бактерий составляет десятки и сотни тысяч в 1 мл.

В воде и донных отложениях протекают окислительно-восстановительные процессы; железо трехвалентное и двухвалентное, ил сероватой окраски. В α – т зоне развиваются организмы, обладающие большой выносливостью к недостатку кислорода и большому содержанию углекислоты. Преобладают растительные организмы с гетеротрофным и миксотрофным питанием. Отдельные организмы имеют массовое развитие. Обильно развиваются нитчатые бактерии, грибы, водоросли. Из животных организмов обильны обрастания сидячими инфузориями (Carchesium), встречаются коловратки, много окрашенных и бесцветных жгутиковых (рис. 4.2).

Рис. 4.1 - Организмы полисапробной зоны:

1–11 – нитчатые бактерии;

12–14 – жгутиконосцы; 15–23 – инфузории

Рис. 4.2 - Альфа-мезосапробные организмы:

1–3 – бактерии; 4 – одноклеточная водоросль; 5–6 – многоклеточные водоросли; 7–13 – инфузории

Бета-мезосапробная зона (β – m) отмечается в водоемах, почти освободившихся от нестойких органических веществ, распад которых дошел до образования окисленных продуктов (полная минерализация).

Количество сапрофитных бактерий составляет тысячи клеток в 1 мл и резко увеличивается в период отмирания водной растительности. Концентрация кислорода и углекислоты сильно колеблется в течение суток, в дневные часы содержание кислорода в воде доходит до пресыщения, и углекислота может полностью исчезать. В ночные часы наблюдается дефицит кислорода в воде.

В иле много органического детрита, интенсивно протекают окислительные процессы, ил желтой окраски.

В этой зоне большое разнообразие животных и растительных организмов. В массе развиваются растительные организмы с автотрофным питанием, наблюдается цветение воды многими представителями фитопланктона. В обрастаниях обычны зеленые нитчатки и эпифитные диатомеи; в иле – черви, личинки хирономид, моллюски (рис. 4.3).

Рис. 4.3 - Бета-мезосапробные организмы:

1–3 – нитчатые бактерии; 4 – зеленые водоросли;

5–6 – водоросли; 7–8 – жгутиковые; 9–10 – инфузории; 11–12 – водоросли; 15 – кольчатые черви; 18–19 – грибы

Олигосапробная зона (о) характеризует практически чистые водоемы с незначительным содержанием нестойких органических веществ и небольшим количеством про­дуктов их минерализации.

Содержание кислорода и углекислоты не претерпевает заметных колебаний в дневные и ночные часы суток. Цветение водорослей, как правило, не наблюдается. В донных отложениях содержится мало органического детрита, автотрофных микроорганизмов и бентосных животных (червей, личинок хирономид и моллюсков).

Показателями большой чистоты воды в этой зоне являются некоторые красные водоросли и водные мхи (рис. 4.4).

Рис. 4.4 - Олигосапробные организмы:

1, 2, 3, 6, 10, 13, 14 – водоросли; 4, 8, 12 – инфузории; 7 – кишечнополостные; 11 – личинка

По мере развития процесса биологического самоочищения возрастает видовое разнообразие, но численность каждого отдельного вида уменьшается:

• в олигосапробной зоне разнообразие видов достигает максимума, зато численность отдельных видов невелика;

• для полисапробной зоны характерны небольшое число видов и очень высокая численность каждого отдельного вида.

Система сапробных организмов полностью отвечает экологическому принципу Тинеманна: «Чем больше условия существования данного местообитания отличаются от оптимальных для большинства видов, тем беднее по видовому разнообразию становится биоценоз и тем характернее и многочисленнее – каждый отдельный вид».

Система Кольквитца и Марссона сразу получила широкое распространение и была использована для оценки санитарного состояния водоемов, особенно в Европе и России. В нашей стране создалась школа санитарных гидробиологов (Я. Я. Никитинский, Г. И. Долгов, С. Н. Строганов, С. М. Вислоух и др.), успешно применявших и развивавших систему санитарно-биологического анализа, т.е. состояние водоема определялось на основе животных и растительных организмов.

Кольквитц и Марссон подчеркивали, что основное значение следует придавать не отдельным видам, а биоценозам, т.е. сообществу показательных организмов.

Очень чистые водоемы практически не несут следов воздействия человека. В России, например, к таким водоемам могут быть отнесены многие озера и реки Сибири, севера Дальнего Востока, а на европейской территории – Ладожское и Онежское озера, Рыбинское водохранилище, некоторые северные реки. В этих водоемах насыщение воды кислородом достигает 95%, БПК не превышает 1 мг/л, а взвешенные вещества – 3 мг/л. Вода в очень чистых водоемах пригодна для всех видов водопользования.

Водоемы, относимые к категории чистых, по химическим показателям почти не отличаются от очень чистых, но следы влияния деятельности человека проявляются, прежде всего, в увеличении количества сапрофитной микрофлоры в воде. Воды водоемов второго класса также пригодны для всех видов водопользования.

Умеренно загрязненные воды характеризуются повышенным содержанием органических веществ, ионов хлора и солей аммония. Они несут в себе признаки загрязнения поверхностным стоком и бытовыми водами. Умеренно загрязненные воды после соответствующей очистки пригодны для хозяйственно-питьевого использования, разведения некоторых видов рыб и для прочих видов водопользования.

К категории загрязненных отнесены реки и озера, природные свойства которых значительно изменены в результате поступления в них сточных вод. В зимний период при образовании ледяного покрова на загрязненных участках водоема могут создаваться анаэробные условия. Загрязненные воды не пригодны для питьевого, хозяйственно–бытового и спортивного назначения, а также для рыбоводства. Они могут быть использованы, да и то с ограничениями, в некоторых производственных процессах, для орошения и судоходства. В странах Западной Европы, при остром дефиците воды, загрязненные воды используют для хозяйственно-питьевого назначения, применяя при этом сложные способы очистки.

В грязных и очень грязных водоемах природные свойства воды сильно изменены. В летний период вода этих водоемов издает неприятные запахи. Повышенное содержание агрессивной углекислоты и сернистых соединений в воде грязных водоемов оказывает вредное воздействие на обшивку судов и портовые сооружения, вследствие чего эти водоемы ограниченно пригодны для судоходства. Для орошения воды грязных водоемов могут быть использованы с ограничениями, не под все культуры.

Для оценки степени загрязнения водоема необходимо пользоваться средними данными, собранными в период наиболее критического состояния водоема. Например, наименьшая концентрация растворенного кислорода наблюдается летом или в период ледостава, температура наиболее высокая – летом. По многим показателям наиболее неблагоприятные условия создаются зимой. Показатели в этот период и принимаются за основу при оценке степени загрязненности водоема.