МЕТОД ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА). ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)

Цель занятия. Ознакомить студентов с принципом метода флуоресцирующих антител и техникой постановки реакции иммунофлуоресценции, с принципом и техникой проведения им-муноферментного анализа.

Оборудование и материалы. Инактивированные культуры бруцелл и сальмонелл, 96%-й этанол, ФСБР (рН 7,2...7,4), «влажная камера» (чашки Петри, эксикатор), люминесцирующие сыворот­ки против бруцелл, сальмонелл, иммуноглобулинов кролика, по­зитивная бруцеллезная сыворотка, готовый препарат для демон­страции результатов ИФА, люминесцентный микроскоп.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

В названных серологических реакциях используют антитела (иммунные сыворотки), меченные флуорохромом или фермента­ми, и в дальнейшем, применяя специальные методы, регистри­руют образование комплекса антиген — антитело. В некоторых вариантах ИФА ферментную метку вводят в антиген.

Метод флуоресцирующих антител (МФА). Этот комплексный метод сочетает в себе серологическую реакцию, при которой происходит специфическое взаимодействие антигена и антитела с образованием иммунного комплекса, и микроскопическое ис­следование, с помощью которого этот комплекс обнаруживают.

В реакции иммунофлуоресценции используют антитела, к ко­торым присоединен флуорохром (чаще флуоресцеин — изотиоцинат). Такие антитела сохраняют способность специфически реагировать с антигеном и благодаря флуорохрому светиться под воздействием ультрафиолетовых лучей. При постановке МФА микробный антиген фиксируют на предметном стекле и обраба­тывают люминесцирующими антителами. Затем препарат отмы­вают водой от несвязавшихся антител и просматривают в люми­несцентном микроскопе. Если антитела специфически соответ­ствуют данному антигену, то они образуют с антигеном прочный комплекс и при люминесцентной микроскопии в препарате об­наруживают светящиеся микробные клетки (рис. 70).

Преимущество МФА как диагностического метода состоит в том, что с его помощью возможно за два-три часа серологически идентифицировать микроорганизм непосредственно в патологи­ческом материале, без выделения в чистой культуре (экспресс-метод). Как и другие серологические реакции, МФА применяют и для выявления антител в крови животных.

Приготовление препарата для МФА. При выявлении возбуди­теля инфекции (антигена) на предметном стекле готовят мазки-отпечатки из органов или другого материала. Чтобы обнаружить антитела в исследуемой сыворотке крови, на предметном стекле готовят мазки из известного антигена, например возбудителя сальмонеллеза, сибирской язвы и др. Препарат с нанесенным материалом (бактериальная суспензия, мазок-отпечаток) подсу­шивают на воздухе и фиксируют ацетоном (5 мин), или этанолом (10.... 15 мин), или метанолом (5...10 мин). Препарат можно фик­сировать и нагреванием, как при обычной световой микроско­пии. Мазки-отпечатки из органов и тканей лучше обрабатывать охлажденным до -20 °С ацетоном 2...4 мин. В зависимости от конкретных задач окрашивание готовых препаратов люминесци­рующими сыворотками проводят различными способами.

Прямой МФА. Разработал Coons с соавт. (1950). На предмет­ное стекло с фиксированным антигеном наносят каплю люминесцирующей иммунной сыворотки в рабочем разведении, со­держащей антитела против искомого антигена. Чтобы избежать высыхания, препарат помещают во влажную камеру (чашку Пет­ри) с фильтровальной бумагой, смоченной водой, и выдержива­ют в термостате при 37...38 °С 15...30 мин. Затем препарат 5... 10 мин промывают от несвязавшихся иммуноглобулинов про­точной (водопроводной) водой с рН не ниже 7,0. Промытый пре­парат высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Прямой МФА используют только для идентификации неизве­стного антигена; к его недостатку относят необходимость приго­товления люминесцирующей сыворотки для каждого вида иден­тифицируемого микроорганизма.

Непрямой МФА.Применяют в двух вариантах.

Двухступенчатый МФА предложили Weller и Coons (1954). Этот вариант считают более универсальным, так как при помощи одной люминесцирующей антивидовой сыво­ротки можно выявлять различные виды микроорганизмов.

На антиген наносят каплю немеченной иммунной сыворотки (сыворотка первой ступени). Препарат выдерживают в термоста­те 15...30 мин, затем его промывают, чтобы удалить несвязавшиеся антитела иммунной сыворотки, и просушивают (см. прямой вариант). Если антитела сыворотки первой ступени соответству­ют антигену, то вода не вымывает образовавшийся АГ—АТ-комплекс (антитела зафиксированы на антигене).

На подсушенный препарат наносят каплю люминесцирую­щей антивидовой сыворотки (сыворотка второй ступени) в ра­бочем титре. Препарат повторно помещают в термостат во влажной камере на 15...30 мин, затем промывают водой и под­сушивают. Антивидовая сыворотка представляет собой мечен­ные флуорохромом антитела против иммуноглобулинов крови животного того вида, от которого получена иммунная сыворот­ка первой ступени. Таким образом, антитела первой сыворотки служат антигеном для меченых антител антивидовой сыворот­ки. В результате к образовавшемуся на первом этапе АГ—АТ-комплексу присоединяются антитела второй ступени, образует­ся двойной комплекс, который можно обнаружить в люминес­центном микроскопе.

Универсальность непрямого варианта обусловлена тем, что, используя на первом этапе полученные от животных одного вида (например, от лошадей) иммунные сыворотки против различных микроорганизмов, на втором этапе с помощью одной антивидо­вой сыворотки можно идентифицировать неограниченное коли­чество возбудителей инфекционных болезней.

Трехступенчатый МФА представляет собой вари­ант РСК на стекле. В данном случае в иммунном комплексе на стекле при помощи люминесцирующей сыворотки выявляют связанный комплемент (рис. 71).

Двухступенчатым или трехступенчатым МФА при использова­нии известного антигена можно обнаруживать антитела в крови животных.

Для подтверждения специфичности результатов МФА необхо­димы контроли. Для прямого варианта достаточно одного конт­роля: гомологичные и гетерологичные в антигенном отношении микроорганизмы обрабатывают люминесцирующей сывороткой. В первом случае наблюдают свечение бактерий, во втором свече­ние отсутствует.

Для непрямого варианта ставят два контроля: 1) мазки, содер­жащие гомологичные и гетерологичные в антигенном отноше­нии микроорганизмы, обрабатывают антивидовой люминесциру­ющей сывороткой. При отсутствии антител первой ступени клет­ки не должны люминесцировать; 2) мазки с гомологичными и ге-терологичными в антигенном отношении бактериями обра­батывают иммунной (антимикробной) сывороткой (первый этап) с последующим нанесением флуоресцирующей антиглобулино-вой (антивидовой) сыворотки (второй этап). Специфическое све­чение бактерий наблюдают в первом случае, во втором оно от­сутствует.

Оценка результатов МФА. Учитывают яркость свечения, цвет, локализацию и структуру свечения. У бактерий, окрашенных (обработанных) люминесцирующей сывороткой, меченной изоцианатом флуоресцеина, обычно наблюдают яркое зеленое све­чение по периферии клетки в виде ободка или ореола, централь­ная часть бактерий светится слабо. Такой характер свечения объясняют тем, что с единицы площади по периферии микроб­ной клетки на сетчатку глаза наблюдателя проецируется в не­сколько раз больше антител, чем с центральной ее части. Следует учитывать, что у пластичных бактерий (лептоспиры, вибрионы) светится вся клетка. У клеток, погруженных в тканевую жид­кость, и у молодых бацилл сибирской язвы контур обычно выражен нерезко.

Интенсивность свечения оценивают по четырехкрестовой си­стеме: 1) (++++) — очень яркая флуоресценция по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с темной централь­ной частью клетки; 2) (+++) — яркая флуоресценция периферии клетки; 3) (++) — слабое свечение периферии клетки; 4) (+) — нет контрастного свечения периферии и центральной части мик­робной клетки. Отсутствие специфического свечения обозначают знаком «минус» (видны тени микроорганизмов). При диагности­ке различных возбудителей болезней положительным результа­том чаще считают специфическое свечение бактериальных кле­ток не ниже, чем на четыре или три креста.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Этот метод получил рас­пространение после того, как была решена задача введения фер­ментной метки в молекулы антител или антигенов. Антитела, связанные с ферментом, сохраняют способность специфически реагировать с гомологичным антигеном, а фермент — взаимодей­ствовать с соответствующим субстратом.

ИФА обычно используют в гистохимическом (иммунопероксидазная реакция) и твердофазном вариантах.

Гистохимический ИФА. При помощи этого метода обычно об­наруживают микробные антигены в мазках-отпечатках, мазках крови, гистосрезах. Как и в случае МФА, пероксидазную реак­цию используют в прямом и непрямом вариантах.

Прямая иммунопероксидазная реакция. В качестве известного компонента используют, меченные пероксидазой антитела против какого-либо патогенного микроорганизма. Препарат, например мазки-отпечатки, фиксируют охлажден­ным ацетоном (-15...-20 °С), подсушивают, наносят четыре-пять капель конъюгата в рабочем титре (меченые антитела), инкуби­руют во влажной камере при 37 °С 1...2ч, промывают физиологи­ческим раствором 15 мин, ополаскивают дистиллированной во­дой, подсушивают, наносят на препарат несколько капель ра­створа субстрата (25 мг 3,3-ДАБ • 4НС1 растворяют в 100 мл 0,05 М трис-буфера с рН 7,5 и 25 мл этого раствора объединяют с 3 мл 0,5%-го раствора перекиси водорода). Препарат с субстра­том выдерживают 5...10 мин, промывают в физиологическом ра­створе 10 мин, ополаскивают дистиллированной водой и микро­скопируют.

Если в исследуемом материале присутствует искомый микроб­ный антиген, то меченные пероксидазой антитела с ним специфически связываются. Внесение субстрата к пероксидазе приво­дит к образованию цветного продукта, видимого при микроско­пии сначала как гранулы голубого, а позднее желто-коричневого цвета.

Непрямая иммунопероксидазная реак­ция. Как и в МФА, используют меченные пероксидазой анти­тела иммуноглобудинам определенного вида животных. На первом этапе фиксированный охлажденным ацетоном препарат с исследуемым материалом обрабатывают во влажной камере при 37...38 ºС 1...2 ч. иммунной сывороткой (0,2...0,3 мл), содержащей немеченые антитела к искомому антигену. Затем препарат про­мывают физиологическим раствором 5 мин, подсушивают и об­рабатывают при 37...38 °С 1...6ч во влажной камере антителами, меченными пероксидазой (конъюгат в рабочем разведении). Последующие операции и учет результатов аналогичны прямому варианту пероксидазной реакции.

Твердофазный ИФА. Применяют наиболее широко. В этом слу­чае антитела или антигены фиксируют на нерастворимых носи­телях: микропанелях, стеклянных или нейлоновых шариках.

При различных вариантах реакции результаты учитывают ин­струментально или визуально.

Обнаружение антигена по схеме «сэндвич» состо­ит из следующих этапов.

Лунки полистироловых микропанелей, сенсибилизируют спе­цифическими для искомого антигена антителами[2] в концентра­ции 10...30 мкг/мл. Обычно в лунку вносят по 0,2 мл раствора ан­тител в буфере с рН 9,6, выдерживают при 37 °С 1 ч и затем ос­тавляют на ночь при 4 "С. Удаляют раствор иммуноглобулинов панели промывают ФСБР (рН 7,4) три раза, чтобы удалить избы­ток свободных (несорбированных) антител.

В лунки вносят по 0,2 мл раствора, содержащего исследуемый антиген, и инкубируют при 37°С 2 ч, затем панели вновь промы­вают, как ранее описано.

В лунки вносят по 0,2 мл меченных ферментом специфичес­ких антител (конъюгат); панели инкубируют при 37 °С 1...2ч, затем их отмывают от несвязавшихся антител.

В лунки вносят 0,2 мл раствора ферментного субстрата [ортофенилендиамин (ОФД) или

5-аминосалициловая кислота — для пероксидазы и р-нитрофенилфосфат — для щелочной фосфатазы] и инкубируют в темноте при 20...22 ºС 5...30 мин.

Реакцию останавливают добавлением 0,05 мл 2 н. раствора серной кислоты (для пероксидазы) и 3 М раствора гидроксида натрия (для щелочной фосфатазы).

Учет результатов визуальный или спектрофотометрический по увеличению поглощения при длине волн 490 нм (пероксидаза) или 405 нм (щелочная фосфатаза). Субстрат ОФД: положитель­ный результат — оранжево-коричневое окрашивание. Субстрат 5-аминосалициловая кислота: положительный результат — ин­тенсивное коричневое окрашивание.

За положительный результат принимают превышение оптической плотности опытных образцов над контрольными в пять-шесть раз.

Обнаружение антител (в сыворотке крови) осно­вано на том же принципе, но твердофазный носитель сенсиби­лизируют известным антигеном, обрабатывают исследуемой сы­вороткой, затем антивидовым иммуноглобулином, меченным ферментом. Вносят субстрат и по цветной реакции судят о нали­чии или отсутствии антител в исследуемой сыворотке крови.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Идентифицировать культуры возбудителей бруцеллеза и сальмонеллеза прямым МФА.

2. Идентифицировать двухступенчатым МФА культуру саль­монелл.

3. Изучить микроскопическую картину при учете результатов гистохимического ИФА (иммунопероксидазный тест).

Контрольные вопросы

1. В чем сущность одноступенчатого, двухступенчатого и трехступенчатого МФА?

2.Для каких целей используют МФА?

3.Какие разработаны варианты ИФА?

Тема 19