СРЕДСТВА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ, ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ 1 глава
Цель занятия. Ознакомить студентов с вакцинами различных типов, лечебно-профилактическими и диагностическими иммунными сыворотками, антигенами, аллергенами и принципами их контроля.
Оборудование и материалы. Вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2, против сальмонеллеза из штамма ТС-177, против лептоспироза, ботулизма, пастереллеза, лечебно-профилактические иммунные сыворотки против пастереллеза, рожи свиней, диагностические агглютинирующие и флуоресцирующие сальмонеллезные сыворотки, диагностические аллергены — бруцеллин, туберкулин, маллеин, стерильные МПА, МПБ, среда Китта—Тароцци в пробирках, агар Сабуро, стерильные пипетки Пастера, физиологический раствор, нефлуоресцирующее иммерсионное Масло, люминесцентный микроскоп, сенсибилизированные бру-целлами морские свинки с положительной реакцией ГЗТ.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Вакцины. Эти биологические препараты содержат в качестве активного начала цельные микробные клетки или их компоненты. Вакцины предназначены для создания искусственного активного иммунитета. Различают несколько основных типов вакцин против инфекционных болезней сельскохозяйственных животных.
Вакцины инактивированные корпускулярные содержат в качестве иммуногенного начала цельные инактивированные микробные клетки. При конструировании вакцин в их состав включают штаммы одного или нескольких сероваров в зависимости от антигенной гетерогенности конкретного возбудителя. Используют штаммы бактерий без признаков диссоциации. Бактериальную массу чаще получают, культивируя вакцинные штаммы в жидких питательных средах в ферментерах. На следующем этапе бактериальные клетки инактивируют физическими (прогревание при 55...60°С, ультразвук, ультрафиолетовое облучение, ионизирующее излучение) или химическими методами (применяют такие средства, как формалин, глутаровый альдегид, бета-пропиолактон, кристаллвиолет, метиленовый синий и т.д.). К любому методу инактивации микроорганизмов предъявляют два основных требования: 1) 100%-я инактивация клеток возбудителя; 2) отсутствие существенных нарушений в антигенных и иммуногенных свойствах клетки возбудителя.
После инактивации устанавливают необходимую концентрацию микробных клеток в 1 мл суспензии (концентрированием или, наоборот, разбавлением), корректируют рН, добавляют тот или иной адъювант, препарат расфасовывают и контролируют.
Анатоксинвакцины содержат в качестве иммуногенного начала инактивированный формалином токсин бактерий. При ряде токсикоинфекций иммунитет в основном антитоксический (ботулизм), обусловленный выработкой антител против бактериального экзотоксина. Для получения анатоксин-вакцин токсинобразующий штамм возбудителя культивируют в жидкой питательной среде в условиях, обеспечивающих максимальное накопление токсина в культуральной жидкости. Затем экзотоксин освобождают от бактерий, добавляют к нему формалин и выдерживают смесь в тепле. Под воздействием формалина токсин переходит в нетоксическую форму (анатоксин), которая сохраняет иммуногенные свойства. В качестве адъюванта в вакцинах подобного типа обычно используют гидроксид алюминия.
Анавакцины: при производстве некоторых вакцин микробную массу и токсин не разделяют, и готовый препарат содержит инактивированные микробные клетки и анатоксин.
Химические вакцины в качестве иммуногенного начала содержат извлеченные тем или иным способом из микробной клетки различные химические соединения. Полученные вещества должны сохранить иммуногенные свойства, т. е. быть протективными антигенами. К преимуществу химических вакцин относят возможность отделить иммуногенный компонент от балластных веществ клетки, что позволяет снизить реактогенность препарата. В принципе к химическим вакцинам можно отнести и анатоксинвакцины.
Живые вакцины — искусственно ослабленные или природные авирулентные (слабовирулентные) штаммы возбудителя, которые утратили способность вызывать у естественно-восприимчивых животных болезнь, но могут в течение определенного промежутка времени размножаться в организме вакцинированного животного, вызывая иммунный ответ. Два основных требования к вакцинным штаммам: 1) отсутствие склонности к реверсии (возвращению в исходное вирулентное состояние); 2) неконтагиозность (возбудитель вакцинного штамма не должен передаваться от вакцинированного животного к невакцинированному). Желательно, чтобы вакцинный штамм нес стабильный маркер, отличающий его от эпизоотических штаммов возбудителя.
Искусственного ослабления вирулентности штамма (аттенуация) достигают многократными пассажами штамма через питательные среды, организм невосприимчивых животных, воздействием физических, химических факторов. Достаточно широко стали применять в качестве вакцинных штаммов ауксотрофные мутанты, не способные синтезировать некоторые жизненно важные соединения, и поэтому, обеспечив иммунный ответ, довольно быстро погибающие в организме животного.
Генно-инженерные вакцины получают, искусственно вводя в клетку микроорганизма определенный ген (например, контролирующий синтез определенного фактора патогенности или другого протективного антигена), что в конечном итоге обеспечивает необходимую иммуногенность вакцинного препарата. В качестве передатчика генов (вектора) обычно используют плазмиды или фаги.
Адъюванты (англ. adjuvant— помогающий) широко используют при конструировании вакцин. Это вещества антигенной и неантигенной природы, различные по химическому составу, которые при совместном с антигеном введении в организм вызывают неспецифическое стимулирование иммуногенеза. Из адъювантов неорганической природы наиболее часто используют гидроксид алюминия — минеральный гель; алюмокалиевые квасцы, хорошо сорбирующие антигены.
К числу наиболее сильных адъювантов относят легкие минеральные масла со стабилизатором — безводным ланолином. Вакцины с такими адъювантами называют эмульгированными (масляными).
Приготовление адъювантных вакцин состоит в добавлении к готовому микробному антигену соответствующего адъюванта в предварительно установленных оптимальных пропорциях.
Контроль вакцин. Вакцины всех типов после приготовления проверяют в основном по трем параметрам.
Стерильность (инактивированные) или чистоту роста (живые) контролируют посевом на питательные среды.
Безвредность проверяют введением вакцины тем или иным лабораторным животным. Вакцина не должна вызывать заболевание и гибель животных.
Активность (иммуногенность) обычно контролируют следующим образом: вакцину вводят группе лабораторных животных, и через промежуток времени, достаточный для выработки активного иммунитета (15...20 сут), эту группу вместе с контрольной группой непривитых животных заражают заведомо летальной дозой возбудителя. Контрольные животные должны погибнуть, 80 % и более вакцинированных должны выжить. В некоторых случаях об иммуногенности препарата судят по косвенным показателям: количеству агглютининов у привитых животных (лептоспирозная вакцина), антитоксинов в РН (вакцина против ботулизма).
Например, сухую живую вакцину против рожи свиней ВГНКИ из штамма ВР-2 контролируют следующим образом.
Для контроля чистоты сухую (лиофилизированную) вакцину разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1: 10. Из суспензии бактерий готовят мазки, красят по Граму, микроскопируют. В препарате должны быть типичные мелкие грамположительные палочковидные клетки при отсутствии посторонних микроорганизмов. Одновременно проводят высевы на МПА, МПБ, среду Китта—Тароцци и агар Сабуро. Посевы выдерживают при 37...38°С 10 сут, посевы на грибы — при 20...25 ºС 15 сут. Рост посторонней микрофлоры в указанные сроки на всех питательных средах должен отсутствовать при наличии типичного роста на МПА и в МПБ культуры возбудителя рожи.
С целью контроля вакцины на безвредность и активность 20 белым мышам массой 17...18 г вводят подкожно 0,2 мл препарата. Вакцину считают безвредной, если погибает не более 5 мышей. Через 14 дней всех оставшихся в живых вакцинированных и пять контрольных мышей заражают культурой вирулентного штамма возбудителя рожи свиней в заведомо летальной дозе. Вакцину признают активной, если погибают в течение трех-четырех суток контрольные и выживает не менее 75 % вакцинированных мышей.
Лечебно-профилактические иммунные сыворотки и иммуноглобулины. Данные биопрепараты применяют для создания пассивного иммунитета при профилактике или лечении. Под пассивной иммунизацией понимают введение готовых иммуноглобулинов (антител) животному. Пассивный иммунитет возникает через 20...24ч после инъекции и длится максимум две-три недели. Иммунные сыворотки получают путем многократного введения антигена животным-продуцентам (волам, лошадям и т.д.). Для получения каждого типа иммунных сывороток разработаны регламенты приготовления соответствующего антигена, схемы иммунизации и методы, с помощью которых контролируют количество антител в сыворотке крови.
По направленности действия иммунные сыворотки подразделяют на антибактериальные, антитоксические, антивирусные. По достижении необходимого уровня антител у животного берут кровь обычно в объеме 1 % массы животного или осуществляют тотальное обескровливание. Полученную кровь сепарируют для получения сыворотки, которую стерилизуют фильтрованием и консервируют 0,25...0,5 % фенола, 0,01...0,03% тиомерсала или другими веществами.
Контроль сывороточных препаратов. Включает в себя проверку на стерильность, безвредность и специфическую активность.
Стерильность препаратов проверяют посевом на питательные среды (МПА, МПБ, МППБ, агар Сабуро или Чапека).
Безвредность каждой серии обычно контролируют введением сыворотки морским свинкам. Специфическую активность сыворотки проверяют в зависимости от направленности ее действия.
Определение превентивных (защитных) свойств на естественно-восприимчивых или лабораторных животных заключается в том, что животным вводят подкожно, внутримышечно или внутрибрюшинно сыворотку, а через 20...24ч иммунизированным и контрольным животным вводят подтитрованную дозу гомологичного вирулентного микроорганизма. Иммунизированные животные должны остаться здоровыми при гибели или характерном переболевании контрольных.
Активность антитоксических и ряда противовирусных сывороток определяют в реакциях нейтрализации. Количество антител в сыворотках устанавливают при помощи различных серологических реакций (РСК, РА, РИГА, РДП и т.д.).
Пример контроля иммунной сыворотки (против рожи свиней).
Контроль стерильности: сыворотку высевают на МПА, МПБ, МГТГТБ, агар Сабуро. Посевы выдерживают при 37 и 20 °С (Сабуро) десять дней. Среды должны остаться стерильными.
Контроль безвредности: пяти белым мышам массой 17...20 г вводят подкожно по 0,5 мл сыворотки, двум морским свинкам массой 250...300 г — по 10 мл. Все привитые животные должны остаться живыми в течение десяти дней.
Контроль активности: пятнадцати белым мышам массой 17...20 г вводят внутрибрюшинно по 0,01, 0,02 и 0,03 мл (по пять мышей на дозу) сыворотки. Через 2 ч всем привитым и пяти непривитым мышам вводят подкожно 0,1...0,2 мл суточной культуры вирулентного штамма возбудителя рожи свиней, разведенной 1:200. Сыворотку считают активной, если в течение десяти дней все привитые животные остаются живыми, а контрольные погибают (допускается гибель двух белых мышей, привитых в дозе 0,01 мл).
Для концентрирования антител иммунной сыворотки, удаления серологически неактивных белков и соответственно повышения специфической активности препарата применяют методы, с помощью которых выделяют глобулиновую фракцию белков иммунной сыворотки. Готовые препараты иммуноглобулинов контролируют, как и иммунные сыворотки: на стерильность, безвредность и специфическую активность.
Диагностические антитела. Принцип получения диагностических иммунных сывороток такой же, как и лечебно-профилактических. Диагностические сыворотки должны характеризоваться не только высокой активностью в серологических реакциях, но и специфичностью. С помощью диагностических сывороток обнаруживают микробные антигены в тканевых материалах и идентифицируют выделенные микроорганизмы. В зависимости от целевого назначения можно говорить о видовых сыворотках (предназначенных для идентификации микроорганизмов на уровне вида), групповых (идентификация на уровне серологической группы), серовариантных (на уровне серовара). Иммунные сыворотки готовят для использования в различных серологических реакциях (РА, РП, РДП, РСК, РИГА, РН). При получении антител, меченных флуорохромом и ферментами, из иммунных сывороток предварительно выделяют и очищают иммуноглобулиновую фракцию. В целом диагностические сыворотки (антительные диагностикумы) контролируют на стерильность, активность и специфичность.
Пример контроля диагностической сыворотки (люминесцирующей сальмонеллезной). Определение активности (красящий титр): схема титрования сальмонеллезной сыворотки показана в таблице 16.
Из 24-часовых агаровых гомологичных культур сальмонелл готовят мазки (негустые), фиксируют их, затем на каждый мазок наносят различные разведения флуоресцирующей сыворотки. В дальнейшем препараты обрабатывают, как описано в теме 18.
Мазки просматривают под люминесцентным микроскопом. Максимальное разведение сыворотки, обеспечивающее свечение гомологичных микробных клеток на три-четыре креста, считают ее красящим титром. Рабочий титр, т. е. используемый в работе, равен половине красящего. Красящий титр для групповых сывороток должен быть не ниже 1:32, для комплексной —1:16.
Контроль специфичности люминесцирующей сыворотки: аналогичным образом на предметных стеклах готовят мазки из гетерологичных сальмонелл и эшерихий (по нескольку культур). Флуоресцирующую сыворотку используют в рабочем титре. Свечения гетерологичных микробов практически не должно быть.
Получение моноклональных антител. Обычные иммунные диагностические сыворотки, выпускаемые биофабриками, представляют собой смесь антител против различных антигенных детерминант возбудителя инфекционной болезни. Использование таких сывороток для идентификации возбудителя сопряжено с получением перекрестных реакций между есроварами одного вида и даже между различными видами микроорганизмов за счет общих антигенных детерминант. Избежать таких нежелательных перекрестных реакций пытаются различными способами. Один из методов заключается в использовании в качестве антигенов для иммунизации животных-продуцентов компонентов клеток возбудителя, несущих преимущественно специфические антигены. Часто такие вещества получают, разделяя антигенную смесь фильтрованием через сефадексы.
Другое традиционное направление в получении специфических реагентов — метод адсорбции иммунных сывороток, когда перекрестно реагирующие антитела удаляют, насыщая сыворотку клетками антигенно родственных бактерий. Клетки бактерий связывают перекрестно реагирующие антитела и потом их вместе с антителами отделяют от адсорбированной сыворотки центрифугированием. Подобным образом получают адсорбированные агглютинирующие сыворотки для идентификации сальмонелл и некоторых других видов бактерий.
В качестве специфических антительных реагентов все чаще используют моноклональные антитела. Обычные диагностические сыворотки — поликлональные, поскольку содержат антитела, синтезированные разными линиями (клонами) В-лимфоцитов к различным антигенным детерминантам. Моноклональные антитела представляют собой иммуноглобулины, продуцируемые одним клоном клеток и реагирующие с определенным антигенным эпитопом микроорганизма.
Чтобы получить моноклональные антитела, изолируют и поддерживают линию лимфоцитов, синтезирующих антитела определенной специфической направленности. Клетки-продуценты антител не способны расти in vitro. Злокачественная опухоль (миелома) синтезирует в больших количествах аномальные иммуноглобулины и способна к неограниченному росту in vitro. Была разработана методика слияния клеток миеломы с лимфоцитами, при этом гибридная клетка (гибридома), как и опухолевая, способна к неограниченному росту и одновременно синтезирует антитела, как лимфоидная. Задача сводится к обнаружению клона клеток, продуцирующих антитела необходимой специфической направленности. Получение моноклональных антител включает в себя несколько этапов.
Известным антигеном иммунизируют животных. Затем из селезенки выделяют В-лимфоциты.
Проводят слияние (гибридизацию) В-лимфоцитов и миеломных клеток. Получают смесь лимфоцитов гибридных и миеломных клеток.
Смесь клеток культивируют в среде, содержащей ГАТ (гипоксантин—аминоптерин—тимидин), что приводит к гибели лимфоцитов и миеломных клеток, так как на указанной среде могут расти только гибридомы.
Гибридомные клетки рассевают (клонируют) таким образом, чтобы в лунке панели для микрокультивирования оказалась только одна клетка, дающая начало клону. После размножения клеток оценивают их способность синтезировать нужные антитела (проводят скрининг). Клонирование повторяют. В конечном итоге выбирают стабильный клон, продуцирующий антитела заданной специфичности.
Клетки гибридом можно длительно хранить в замороженном состоянии (в жидком азоте).
Моноклональные антитела выделяют либо из культуральной жидкости (клетки гибридомы выращивают in vitro), либо из асцитической (выращивание in vivo).
Моноклональные антитела используют для диагностики инфекционных болезней в иммуноферментном, радиоиммунном и иммунофлуоресцентном анализах.
Диагностические антигены. Предназначены для постановки различных серологических реакций с целью серодиагностики инфекционных болезней животных. В зависимости от типа серологической реакции антигены могут быть корпускулярными (РА, РСК), на носителях (эритроцитарные антигенные диагностикумы для РИГА), растворимые (РП, РДП). Технология приготовления антигенов разнообразна, но основой для антигенов любого типа служат исходные селекционированные, без признаков диссоциации культуры микроорганизмов.
Контроль диагностических антигенов при выпуске проводят по следующим параметрам.
Контроль стерильности (см. вакцины).
Антиген для серологических реакций должен находиться в определенной оптимальной концентрации, выраженной, например, количеством микробных клеток в 1 мл.
Активность антигена определяют в той или иной серологической реакции с заведомо положительной сывороткой. Антиген должен давать четкую положительную реакцию. В некоторых случаях сначала устанавливают предельный титр антигена — разведение, в котором он дает положительную реакцию с наибольшим разведением стандартной положительной сыворотки. Для постановки серологической реакции при диагностических исследованиях используют рабочий титр антигена — двойную дозу предельного титра (единый бруцеллезный антиген).
Специфичность антигена испытывают в серологической реакции с заведомо отрицательной сывороткой.
Корпускулярные антигены для серологических реакций осадочного типа контролируют на спонтанную агглютинацию — выпадение в осадок в отсутствие антител.
Пример контроля диагностического антигена (бруцеллезного антигена для кольцевой реакции с молоком).
Используют клетки бруцелл стандартной концентрации, окрашенные гематоксилином.
Контроль стерильности: см. контроль вакцин.
Контроль специфичности и активности (табл. 17). Берут 10 проб свежего молока от здоровых коров. Молоко каждой пробы исследуют с разными количествами положительной бруцеллезной сыворотки.
Антиген признают специфичным, если во всех пробирках, в которые не добавляли положительную сыворотку, получен отрицательный результат — молоко окрашено, заметно белое кольцо отстоявшихся сливок. Антиген признают активным, когда во всех трех пробирках каждой пробы с позитивной сывороткой или в пробирках с 0,15 и 0,1 мл сыворотки получен четкий положительный результат — молоко белое, слой сливок синего цвета.
Диагностические аллергены. Данные биопрепараты (бруцеллин, туберкулин, маллеин) представляют собой экстракты из клеток возбудителя и содержат продукты их метаболизма. Аллергическая диагностика основана на выявлении гиперчувствительности замедленного типа, которая развивается при ряде инфекционных болезней, особенно хронических. В основе этих диагностических тестов лежит специфическая реакция иммунного воспаления с участием сенсибилизированных Т-лимфоцитов.
Пример контроля диагностических аллергенов (бруцеллина, предназначенного для диагностики бруцеллеза).
Контроль стерильности: см. контроль вакцин.
Контроль безвредности: бруцеллин в объеме 0,5 мл вводят в область спины белым мышам массой 18...25 г. В течение десяти дней животные должны остаться живыми и без воспалительной реакции на месте инъекции.
Контроль специфичности: морским свинкам белой масти в депилированный участок боковой поверхности туловища внутрикожно вводят бруцеллин в объеме 0,1 мл и сравнивают с эталонным препаратом. При учете результатов через 24 и 48 ч на месте инъекции не должно быть аллергической реакции. Кроме того, десяти здоровым овцам бруцеллин вводят под кожу нижнего века по 0,5 мл (пальпебрально) и внутрикожно в подхвостовую складку по 0,2 мл. Контролем также служит эталонный аллерген. Аллерген считают специфичным, если у здоровых животных аллергических реакций не возникает. Кроме того, проверяют аллерген на антигенные свойства, для этого у овец через 10... 15 сут после введения аллергена исследуют в РА и РСК сыворотку крови — антител не должно быть.
Контроль активности: 10... 15 белым морским свинкам вводят подкожно (0,25... 1) • 109 клеток штамма В. melitensis Rev-l для аллергической сенсибилизации. Через четыре недели в депилированный участок кожи вводят 0,1 мл исследуемого бруцеллина и в качестве контроля эталонный аллерген. Реакцию учитывают через 24 ч, измеряя диаметр эритем (отека).
Интенсивность реакции на исследуемый и эталонный аллергены должна быть одинаковой.
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1. Провести контроль чистоты и безвредности живой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2.
2. Изучить образцы инактивированных сорбированных, эмульгированных и живых вакцин.
3. Провести контроль активности и специфичности люминес-цирующих сальмонеллезных сывороток.
4. Учесть результаты бруцеллиновой кожно-аллергической пробы на сенсибилизированных морских свинках.
Контрольные вопросы
1.Какие различают типы вакцин?
2.Что такое адъюванты?
3.Как контролируют вакцины, лечебно-профилактические и диагностические иммунные сыворотки?
4.В чем заключается преимущество диагностических препаратов на основе мо-ноклональных антител?
Тема 21
ОТБОР, КОНСЕРВИРОВАНИЕ, ТРАНСПОРТИРОВКА И ХРАНЕНИЕ МАТЕРИАЛА ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ. ПРИНЦИПИАЛЬНАЯ СХЕМА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
Цель занятия. Ознакомить студентов с общими правилами отбора, консервирования, транспортировки и хранения материалов для микробиологического исследования. Рассмотреть этапы микробиологического исследования.
Оборудование и материалы. Кролик, иглы для взятия крови, центрифужные пробирки, центрифуги, 96%-й этанол, ватные тампоны, глицерин, физиологический раствор, лед, поваренная соль, термос, термометр, труп животного (кролик, морская свинка), кюветы с парафином или доски для вскрытия животных, пинцеты, ножницы, склянки для патологического материала, схемы бактериологического исследования при диагностике болезней бактериальной этиологии (бруцеллез, стафилококкоз и т.д.).
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Отбор материала для микробиологического исследования. Правильный отбор материала и его транспортировка в значительной мере определяют успех исследований.
Материал берут с учетом клинических признаков болезни, которые указывают на поражение той или иной системы, патолого-анатомической картины при вскрытии (изменения в различных органах — печени, легких, кишечнике и т. д.), а также основываясь на предполагаемом диагнозе, поскольку для каждой инфекции характерна определенная локализация возбудителя в организме.
Материал для исследования берут прижизненно или посмертно (от павших или убитых с диагностической целью животных). Во всех случаях желательно материал брать от животных, не подвергавшихся лечению антибиотиками, и в максимально короткие после их гибели сроки, так как через 2...3ч после смерти нормальная микрофлора начинает проникать в органы и ткани, что затрудняет выделение возбудителя в виде чистой культуры. Чтобы избежать контаминации посторонней микрофлорой, исследуемый материал берут стерильно, с использованием стерильного инструмента и посуды для транспортировки.
Трупы мелких животных направляют в лабораторию целиком.
Паренхиматозные органы и их фрагменты (у крупных животных) берут, соблюдая требования асептики. Каждый орган (фрагмент) помещают в стерильную посуду, транспортируют в нативном виде или консервируют одним из способов.
Трубчатые кости очищают от мышц, сухожилий, заворачивают в ткань, смоченную 5%-м раствором фенола, или пересыпают поваренной солью и затем заворачивают в ткань.
Гной, пунктаты органов, экссудат берут при помощи стерильного ватного тампона, шприца.
Кровь рекомендуют брать при лихорадочных состояниях стерильным шприцем в количестве 15...20 мл. Кровь, а также другие жидкие материалы можно отбирать стерильной пастеровской пипеткой с последующим запаиванием ее кончика.
Моча: наружные половые органы обмывают, ополаскивают стерильным физиологическим раствором, осушают стерильным марлевым тампоном. Первую порцию мочи не берут, последующую в необходимом количестве набирают в стерильную посуду.
Мокрота: собирают до приема корма. Из трахеи берут при помощи стерильного трахеотубуса и стерильного ватного тампона на проволоке. При глубоком (до бифуркации) введении тампона возникает кашель и удается получить бронхиальную слизь. Тампон с материалом помещают в пробирку со стерильным физиологическим раствором. При взятии материала из носоглотки используют специальные приборы, носоглоточные тампоны на изогнутой проволоке, носовые ватно-марлевые тампоны.
Секрет молочной железы: сосок обмывают водой, обрабатывают этанолом, ополаскивают стерильным физиологическим раствором, сцеживают и удаляют первую порцию секрета, для микробиологического исследования берут последующие порции молока.
Спинномозговая жидкость: обычно берут при наличии менингоэнцефалитического синдрома путем пункции.
Кишечник: если исследуют содержимое кишечника, то пересылают отдельные отрезки (сегменты) кишечника, перевязанные на концах лигатурами. В остальных случаях интересующие отрезки кишечника освобождают от содержимого, промывают стерильной водой и помещают в банку со стерильным 30%-м водным раствором глицерина или насыщенным раствором хлорида натрия. Кишечник отправляют в лабораторию вместе с регионарными лимфатическими узлами.
Фекалии берут стерильными ватными или ватно-марле-выми ректальными тампонами, которые вводят на 8...10 см в прямую кишку, а затем помещают в стерильную пробирку. Если нет возможности сразу сделать посев, используют консервирующие смеси. В противном случае нарушается исходное количественное соотношение микробных видов и размножение некоторых бактерий может привести к инактивации искомого возбудителя.
Консервирование, транспортировка и хранение материала. Материал помещают в стерильную стеклянную посуду (пробирки, флаконы, банки и т. д.), закупоривают.
При подозрении на особо опасные инфекции сосуды с материалом помещают в герметичный металлический пенал (ящик), который опечатывают.
Транспортировку и хранение материала до исследования проводят таким образом, чтобы предотвратить размножение сопутствующей микрофлоры и инактивацию искомого микроорганизма. С этой целью исследуемый материал (кусочки органов) помещают в стерильную смесь равных объемов глицерина и физиологического раствора или помещают в термос, содержащий: 1) снег или лед и поваренную соль (в соотношении 3:1), температура смеси — 15...-20 ºС; 2) равные части сухого льда и этанола, температура смеси около —70 °С.
Для консервирования материала, содержащего энтеробактерии, используют смеси, в которых исследуемый материал должен составлять 1/3 общего объема.
Глицериновая смесь: глицерин — 500 мл, физиологический раствор — 1000 мл, рН смеси доводят до 7,8...8,0 добавлением 20%-го раствора гидрофосфата калия. Смесь стерилизуют дробно, текучим паром.
Фосфатная буферная смесь: дистиллированная вода— 1000мл, дигидрофосфат калия —0,45г, гидрофосфат калия — 5,34 г. Стерилизуют при 121 °С 20 мин.
Для энтеробактерий используют также накопительные среды (селенитовая, магниевая, желчный бульон), которые должны составлять 4/5 общего объема. Независимо от способа консервирования фекалии транспортируют и сохраняют до посева при 2...6°С.
В сопроводительном документе указывают: название и адрес хозяйства, фамилию ветеринарного работника, направляющего материал, вид животного, от которого материал получен, характер материала, на какую инфекцию необходимо исследовать. Кроме того, прилагают протокол патологоанатомического вскрытия и описание клинико-эпизоотологических данных.
Дата добавления: 2016-07-22; просмотров: 2189;