ВИРУЛЕНТНОСТИ И ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель занятия. Ознакомить студентов с техникой заражения лабораторных животных, целями и правилами их бактериологи­ческого исследования. Освоить методы определения вирулентно­сти микроорганизмов и тестирования факторов патогенности бактерий.

Оборудование и материалы. Кровяной МПА в чашках Петри, стерильная плазма кролика (человека), культуры Е. coli, трупы мышей, зараженных Е. coli, белые мыши, морские свинки, кро­лики, стерильные шприцы, иглы, физиологический раствор.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Экспериментальное заражение лабораторных животных (био­проба). Этот метод применяют для выделения из исследуемого материала возбудителя болезни, испытания патогенности изучае­мого микроорганизма, определения эффективности вакцин, им­мунных сывороток и т. д.

О патогенности микроорганизма судят по его способности вызывать заболевание или гибель зараженного животного, а так­же по отдельным факторам патогенности (косвенные признаки).

Для заражения используют лабораторных животных разных видов (мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов, голубей и др.). Выбор животного зависит от его чувствительности к иссле­дуемому виду микроорганизма. В отдельных случаях заражают естественно-восприимчивых животных (свиней, крупный рога­тый скот, овец и т. д.). Если изучают выделенную культуру мик­роорганизма, то для заражения берут 18...24-часовую агаровую или бульонную культуру. При заражении животных исследуемым материалом (ткани органов, гной, слизь, кровь и т. д.) последний предварительно растирают в ступке со стерильным физиологи­ческим раствором. Для опыта берут животных, одинаковых по массе и возрасту.

Перед заражением животных метят: кроликов и морских сви­нок — металлическими ушными номерами; мышей и крыс — ра­створом краски (фуксин, метиленовый синий и т.д.). Для удоб­ства и безопасности работы животных фиксируют. Морских сви­нок помощник держит брюшком вверх так, чтобы средний палец левой руки находился на шее, а большой и указательный — у передних конечностей животного. Правой рукой придерживают задние конечности. Мышь берут одной рукой за кончик хвоста, другой — за кожную складку затылка и поворачивают в нужное положение. Крыс фиксируют корцангами, захватив складку кожи затылка, плотно прижимают голову к поверхности стола, другой рукой держат за хвост и поворачивают в нужное положение, от­тягивают корцангом голову (рис. 51...53).

Методы заражения животных. При заражении используют только стерильные инструменты — шприцы, иглы, ланцеты, пинцеты и др.

Скарификация (накожное заражение): на месте зара­жения предварительно выстригают шерсть и дезинфицируют кожу, затем скальпелем делают небольшие надрезы кожи (насеч­ки) и в них втирают жесткой щеточкой исследуемый материал или бактериальную культуру.

Внутрикожное заражение: пальцами левой руки оттягивают кожу и в образовавшуюся между ними кожную склад­ку вводят кончик иглы. Объем вводимого материала не должен превышать 0,2 мл. Показатель правильного введения — припух­лость размером с горошину.

Подкожное заражение: пальцами левой руки оття­гивают кожу, в образовавшийся «кармашек» — складку вводят иглу шприца, затем его содержимое. Место заражения у кроли­ков — со стороны спины, несколько сбоку, у белых мышей и крыс — со спины к основанию хвоста. Объем вводимого матери­ала не должен превышать для мышей 1 мл, для крыс, морских свинок — 10 мл, кроликов — 20...25 мл.

Внутримышечное заражение: материал чаще вводят с внутренней поверхности бедра. Голубей и кур заражают также и в грудную мышцу. Объем вводимого материала мышам 0,5 мл, морским свинкам и крысам по 3...5 мл, кроликам 5...8 мл, большие дозы следует вводить дробно в два-три места.

Внутрибрюшинное (интраперитонеальное) зара­жение: животное фиксируют головой вниз, иглу шприца вво­дят в нижнюю треть живота, чуть отступя от белой линии. Доза не должна превышать 0,1...0,2 мл.

Внутривенное заражение: исследуемый материал вводят кроликам в краевую вену уха, мышам и крысам — в вену хвоста. Перед заражением место инъекции протирают тампоном, смоченным ксилолом или теплой водой, чтобы вызвать наполнение сосудов кровью.

Интрацеребральное заражение: животных фик­сируют в положении на спине. У кроликов трепанируют череп на участке между надбровным углом и черепным гребнем. Выстрига­ют шерсть и дезинфицируют кожу, пальцами левой руки растяги­вают ее над глазницей параллельно черепному гребню и рассекают (края раздвигают), крестообразно разрезают надкостницу, малень­ким трепаном прокалывают осторожно черепную кость, осторож­ным поворотом выпиливают диск и этот небольшой кусочек кости извлекают. Шприцем вводят 0,2 мл исследуемого материала. Пос­ле этого осторожно соединяют края надкостницы, кожную рану закрывают тампоном и заливают коллодием. У мышей и крыс тре­панацию не делают, а легким проколом костной ткани черепа вво­дят кончик тонкой иглы и инъецируют материал.

Интраназальное заражение: животное предва­рительно слегка наркотизируют, прикладывая к носу вату, смо­ченную эфиром, затем с помощью глазной пипетки вводят мате­риал.

Оральное заражение: исследуемый материал добав­ляют в корм, воду или вводят через небольшой зонд.

Кроме того, животных заражают в переднюю каме­ру глаза.

Бактериологическое исследование трупа животного. Проводят с целью выделения чистой культуры микроба при диагностических исследованиях либо для подтверждения специфической природы гибели животного при заражении чистой культурой микроорга­низма.

Трупы животных вскрывают, соблюдая правила асептики. Тело животного фиксируют в положении на спине на доске или в кювете с парафином. Кожно-шерстный покров дезинфицируют 5%-м раствором фенола или лизола. Разрезают кожу по белой линии от промежности до грудинно-ключичного сочленения. За­тем кожу отделяют от мышц, делают поперечные надрезы и кож­ные лоскуты отводят в сторону. Пинцетом захватывают мечевид­ный отросток, под ним надрезают мышцы, ножницами с обеих сторон рассекают ребра, грудину откидывают кверху.

Сначала вскрывают грудную полость. Учитывают патолого- анатомическую картину, записывают данные в журнале экспер­тизы. Поверхность сердца, легких, лимфатических узлов прижи­гают раскаленным шпателем, пастеровской пипеткой прокалы­вают в этом месте орган, насасывают небольшое количество кро­ви (тканевой пульпы) и высевают ее на питательные среды, соблюдая стерильность (рис. 54).

Затем вскрывают брюшную полость. Пинцетом оттягивают вверх брюшную стенку и ножницами разрезают ее от диафрагмы до анального отверстия (важно не повредить кишечник!). Осматривают органы брюшной полости, отмечая размеры, цвет и кон­систенцию паренхиматозных органов, состояние кишечника, на­личие экссудата в брюшной полости и его характер. Также после прижигания поверхности делают посевы из печени, почек, селе­зенки, лимфатических узлов, в случае необходимости из содер­жимого кишечника и других органов. Параллельно из тканей ор­ганов готовят мазки-отпечатки для микроскопического исследо­вания: стерильными ножницами отрезают кусочек органа и к по­верхности разреза несколько раз отдельными участками прикладывают предметное стекло; препарат подсушивают на воздухе, фиксируют, окрашивают, микроскопируют.

По аналогичной схеме исследуют трупы и других эксперимен­тально зараженных животных, а также отдельные органы и ткани сельскохозяйственных животных (патологический материал), по­ступающие в лабораторию для исследования. При работе с тру­пами соблюдают меры, предупреждающие распространение воз­будителя инфекции. После окончания исследования кюветы, доски, рабочий стол дезинфицируют. Инструменты стерилизуют. Трупы животных и отдельные органы обеззараживают автоклавированием или сжигают в трупосжигательной печи.

Определение вирулентности и токсигенности микроорганизмов. В повседневной диагностической практике обычно ограничиваются установлением факта патогенности микроорганизма; при оценке биопрепаратов необходимы количественные характеристики ви­рулентности микроорганизма, взятого для заражения животного.

Вирулентность (токсигенность) микроба измеряют в специальныx условных единицах: абсолютная летальная доза (Dсl — dosis certae letalis) вызывает гибель 100 % зараженных животных; 50%-я летальная доза (LD50) — 50 % зараженных животных; 50%-я инфицирующая доза (ID50) вызывает заболевание 50% заражен­ных животных. LD50 и ID50 —наиболее точные показатели, по­скольку отражают чувствительность к возбудителю (токсину) большинства взятых в опыт животных, a Del показывает чувстви­тельность наиболее устойчивых особей.

Для расчета LD50 исследуемой культуры микроорганизма ис­пользуют один из приведенных методов. Готовят суспензию бак­терий с известным содержанием микробных клеток в единице объема. Затем делают последовательные (2, 5, 10-кратные) разве­дения суспензии на стерильном физиологическом растворе и рав­ные объемы каждого разведения вводят (подкожно, внутрибрю-шинно и т. д.) чувствительным лабораторным животным. Если оп­ределяют летальный эффект, то учитывают количество погибших животных и рассчитывают LD50. Поскольку обычно ни одна из доз возбудителя не приводит к гибели строго 50 % зараженных живот­ных, LD50 определяют статистическими методами.

Расчет LD50 по методу Рида и Мета. Например, из суспензии с концентрацией клеток 109/мл были приготовлены десятикрат­ные разведения Ю-2, Ю-3 и т.д. По 0,5мл каждого разведения ввели внутрибрюшинно шести белым мышам. Результаты зара­жения показаны в таблице 3.

В графах 3 и 4 приведены фактические цифры гибели живот­ных, зараженных различными дозами возбудителя. В графах 5 и 6 указаны так называемые кумулятивные данные. Например, в графе 5 напротив дозы 10^-2 стоит число 14, оно получено из предположения, что при заражении всех мышей одной этой до­зой (максимальной) пали бы все животные, которые погибли после введения меньших доз (10^-3, 10^-4 и т.д.). Поэтому мы име­ем формальное право суммировать напротив дозы 10^-2 в графе 5 всех мышей, павших от этой и меньших доз: 6 + 5 + 2 + 1 = 14 мышей. Аналогичным образом определяем кумулятивные дан­ные в графе 5 напротив каждой дозы Таким же образом определяем кумулятивные данные для всех доз по графе 6 (выжившие животные). Например: при заражении мышей минимальной дозой 10^-6 выжило 6 мышей и, безусловно, выжили бы все животные, которые остались живы после зараже­ния большей дозой бактерий. Исходя из этого, кумулятивный показатель при дозе 10^-6 составляет: 6 + 5 + 4+1 = 16 мышей. Аналогичным образом определяем это число для остальных доз.

На следующем этапе, основываясь на кумулятивных данных, рассчитывают процент гибели мышей при заражении каждой до­зой микроорганизма. Как видно, ни одна доза не приводит к гибели 50 % мышей, и этот показатель рассчитывают математи­чески.

В нашем случае LD₅₀ находится между дозами 10^-3 и 10^-4, не­много ближе к 10^-4. Маленькую разницу (от 37,5 до 50 %) соотне­сем с большей (от 88,8 до 37,5 %) и получим фактор пропорцио­нальности, на который доза 10^-4 отличается от LD₅₀. Этот фактор умножаем на логарифм разведения, который в нашем примере равен 1,0 (фактор = 10, lg 10 = 1,0). Эту величину вычитаем из 10^-4 и получаем LD₅₀:

50-37 5=12 5

-------- ------ —=0,243 (фактор пропорциональности);

88,8—37,5=51,3

0,243-1 =0,243; 4,0-0,243 = 3,756.

Следовательно, LD5₀=10^-3,756. Чтобы найти разведение бакте­риальной суспензии, соответствующее вычисленному показате­лю LD₅₀, используют логарифмические таблицы. Антилогарифм и одновременно искомое разведение составляют 1 : 5747. Для за­ражения животных использовали суспензию бактерий с концент­рацией клеток 10⁹/мл в объеме 0,5 мл, следовательно, LD₅₀ = 10⁹ 0,5/5747 = 87 000 микробных клеток.

Расчет LD₅₀ по методу Кербера. Для получения точных резуль­татов необходима положительная ответная реакция в диапазоне от 100 до 0 %.

Рассмотрим пример расчета на основании тех же данных, ко­торые приведены в таблице 3.

Сумму констант (2,32) рассматривают как характеристику процесса в целом. Логика дальнейших рассуждений следующая.

Из суммы 2,32 вычитаем значение константы, соответствую­щей 50%-й реакции (0,5): 2,32 - 0,5 = 1,82. На степень 1,82 пока­затель LD₅₀ отличается от 100%-й реакции.

Число 1,82 умножаем на значение логарифма интервала меж­ду разведениями исходной бактериальной суспензии, а посколь­ку разведения десятикратные, то получим

1,82 - 1,00= 1,82.

Далее суммируем 1,82 с показателем степени разведения сус­пензии (1/102), при котором константа реакции равна 1,0: 1,82 + 2,0 = 3,82, т. е. LD50 = 10^-3,82 Все это можно выразить следующей формулой:

LD₅₀ = lgl/10² + lg 10 (Е-0,5),

где lg 1/10² — логарифм разведения с константой реакции 1,0; lg 10 — логарифм ин­тервала (кратность разведения может быть 2, 5 и т. д.); X — сумма констант реак­ций.

Используя таблицу антилогарифмов, показатель 10^-3,82 пере­водят в абсолютную величину.

Выявление токсинов микроорганизмов. Обнаружение экзоток­синов лежит в основе лабораторной диагностики многих инфек­ционных заболеваний (ботулизма, энтеротоксемии овец и др.), а также микотоксикозов. В этих случаях материал, предположи­тельно^ содержащий токсин, вводят (скармливают, наносят на поверхность кожи) чувствительным биологическим моделям (ла­бораторные, сельскохозяйственные животные и др.) и по их ги­бели, заболеванию, изменениям в органах и тканях судят о нали­чии токсина. Разработаны иммунологические методы идентифи­кации токсинов (см. тему 19).

Кроме того, обнаружение токсинов и определение их количе­ства необходимы для приготовления биопрепаратов. Например, иммунитет при ботулизме, энтеротоксемии в значительной мере антитоксический, присутствие токсина (в виде анатоксина) в вакцине определяет иммуногенность препарата. Поэтому необ­ходимо точно определять количество токсина в культуральной жидкости. В этом случае устанавливают содержание токсина в 1 мл культуральной жидкости на чувствительных животных, рас­считывая LD₅₀, например, по методу Кербера.

Выявление других факторов патогенности микроорганизмов. Заключение о патогенности микроорганизма делают как по ре­зультатам биопробы (прямое доказательство), так и по ряду при­знаков, косвенно свидетельствующих о патогенных свойствах выделенного микроба. Наиболее часто применяют следующие тесты.

Тест на плазмокоагулазу. Коагулаза — фермент бактерий (стафилококков), который в сочетании с некоторыми компонентами сыворотки коагулирует плазму. Благодаря коагу-лазе вокруг стафилококковых поражений образуется фибриноз­ный барьер, облегчающий персистенцию бактерий в тканях, кро­ме того, отложения фибрина на поверхности бактериальных кле­ток затрудняют их фагоцитоз.

Петлю бактериальной массы исследуемой культуры, снятой с поверхности агаровой среды, смешивают с 0,5 мл плазмы крови кролика (человека), не разведенной или разведенной стериль­ным физиологическим раствором в соотношении 1 : 4, инкубиру­ют при 37 ºС, результаты учитывают через 4 и 24 ч. Положитель­ная реакция — образование сгустка.

Тест на гиалуронидазу. Гиалуронидаза — фер­мент, расщепляющий гиалуроновую кислоту и, как следствие, деполимеризующий межклеточное вещество. Рассматривают как фактор инвазивности бактерий. Получение гиалуронового суб­страта (из пупочных канатиков) — довольно сложная процедура. На практике удобнее использовать тест декапсуляции бактерий. В качестве субстрата в этом случае берут культуры бактерий, в капсульном веществе которых есть гиалуроновая кислота (P. multocida серовар A, S. equi).

На поверхность агара в чашке Петри дробно засевают культу­ру P. multocida или S. equi. Затем в виде линии высевают на поверхность среды культуру микроорганизма, у которого выявля­ют способность к синтезу гиалуронидазы. Чашки с посевами ин­кубируют при 37 °С 16...24 ч. Если исследуемый микроорганизм выделяет гиалуронидазу, то она диффундирует в толщу питательной среды и разрушает капсулу тест-микроба. При анализе посе­вов в косопроходящем пучке света колонии S. equi (P. multocida) вблизи «штриха» исследуемой культуры меньше по размеру, се­рого или голубого цвета в отличие от флуоресцирующих отдален­ных колоний.

Тест на гемолизин. Бактериальные гемолизины — обширная группа веществ-мембранотоксинов, которые вызыва­ют нарушение целостности мембраны эритроцитов и их лизис.

Исследуемую культуру уколом или дробно засевают в чашки Петри с 5%-м кровяным агаром, посевы инкубируют при 37 °С 24 ч. Гемолизин, выделяемый растущей культурой бактерий, диффундирует в толщу агара и вызывает лизис эритроцитов, что проявляется в виде светлой (бета-гемолиз) или полупрозрачной (альфа-гемолиз) зоны вокруг колоний. Гемолитическую актив­ность микроорганизма можно также определять его посевом в 1 ...5%-й кровяной бульон, который после культивирования вы­деляющего гемолизин микроба становится прозрачным за счет лизиса эритроцитов.

Тест на фибринолизин (стрептокиназу). Многие гемолитические стрептококки образуют стрептокиназу, которая активирует протеолитический фермент плазмы (плазминоген → плазмин), этот фермент — фибринолизин растворяет коагулиро­ванную плазму.

Исследуемую культуру микроорганизма засевают в виде «бляшки» на агар с 12% цитрированной плазмы. Посевы инку­бируют при 37 ºС 23...24 ч. Положительный результат — появле­ние зоны просветления вокруг колонии.

Тест на лецитиназу. Лецитиназа расщепляет гидро­лизом лецитин. Готовят желточный агар: пептон — 20 г, гидро­фосфат натрия — 2,5 г, натрий — 1 г, 0,5%-й раствор сульфата магния — 0,1 мл, глюкоза—1 г, агар—12,5 г, вода дистиллиро­ванная — 500 мл. Устанавливают рН 7,2...7,4, стерилизуют при 121 °С 15 мин, охлаждают до 55 ºС, добавляют один стерильный желток на 500 мл среды, компоненты перемешивают и смесь раз­ливают в чашки Петри.

Исследуемую культуру засевают дробно на желточный агар, культивируют при 37...38 °С 24...48 ч. Положительный резуль­тат — появление зоны помутнения вокруг колоний.

Тест на ДНК-азу. Исследуемую культуру бактерий засевают «штрихом» на питательный агар с ДНК и культивируют при 37 °С 24 ч. Затем на поверхность среды с бактериальной культурой наливают 1 н. раствор соляной кислоты. Положитель­ный результат — при гидролизе ДНК вдоль «штриха» культуры видна светлая зона.

Питательная среда с ДНК: в расплавленный МПА добавляют 10%-й раствор ДНК до конечной 0,2%-й концентрации, переме­шивают компоненты, автоклавируют при 120 °С 15 мин и разли­вают в чашки Петри.

Тесты на другие ферменты. Как факторы патогенности можно рассматривать ферменты, катализирующие ре­акции с образованием токсических продуктов, например: уреаза гидролизует мочевину с образованием аммиака; декарбоксилаза декарбоксилирует аминокислоты с образованием аминов и т.д. Методы обнаружения этих ферментов изложены в теме 9.

Тест на адгезины. В адгезии бактерий принимают участие различные компоненты оболочки. Это свойство выявля­ют по способности исследуемого микроорганизма сорбироваться на различных эукариотических клетках (эритроциты, энтероциты) или других частицах (латекс). Еще один метод обнаружения адгезинов связан с их использованием в качестве антигенов в се­рологических реакциях. У эшерихий адгезивные свойства часто определяют по их способности агглютинировать эритроциты.

В лунки планшетов вносят по 50 мкл 4%-й суспензии отмытых эритроцитов морской свинки, 1%-й раствор D-маннозы, суспен­зию исследуемых бактерий с концентрацией клеток 109/мл. Па­раллельно ставят реакцию в отсутствие маннозы. Результат учи­тывают через 30...60 мин. Положительная реакция — склеивание и оседание эритроцитов в виде «зонтика». Торможение агглюти­нации маннозой обозначают как маннозочувствительную ГА (гемагглютинация), отсутствие ингибирования — как маннозорезистентную ГА.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Освоить методы заражения лабораторных животных.

2. Провести бактериологическое исследование трупа лабора­торного животного.

3. По готовым цифровым данным рассчитать LD50 микроорга­низма.

4. Ознакомиться с проявлением гемолитической, плазмокоа-гулазной, гиалуронидазной активности микроорганизмов.

Контрольные вопросы

1. Какими методами заражают лабораторных животных?

2. Каковы основные правила бактериологического исследования трупов живот-
ных?

3.С какой целью и какими методами рассчитывают LD50 микроорганизмов?

4.Какими методами определяют факторы патогенности микроорганизмов?

Тема 14