ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ (БИОХИМИЧЕСКИЕ) СВОЙСТВА И ПРИНЦИПЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель занятия.Ознакомить студентов с методами изучения ферментативной активности и принципами идентификации микроорганизмов.

Оборудование и материалы. Засеянные среды Гисса (глюкоза, лактоза, сахароза и т.д.) с признаками кислото- и газообразова­ния, культуры Е. coli на МПБ в пробирках, реактив Эрлиха, куль­туры В. subtilis на молоке, МПЖ, культуры S. aureus на МПА в пробирках, 3%-й раствор перекиси водорода и другие тесты, ре­зультаты определения ферментативной активности культур Е. coli и S. typhimurium на ПБДЭ-пластинах, карточки с описанием свойств отдельных видов бактерий для работы с определителями.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Изучение ферментативной активности микроорганизмов. В пре­делах семейства у представителей разных родов можно обнару­жить как общие для семейства, так и специфические для родов наборы ферментов. У микроорганизмов разных видов в пределах одного рода есть общие (родовые) и специфические для отдель­ных видов ферменты. Таким образом, каждый вид микроорга­низмов характеризуется специфическим набором ферментов, по­этому определение ферментного спектра — важнейший этап идентификации микроорганизмов.

О наличии того или иного фермента судят по способности микроорганизмов воздействовать на известный субстрат. При­сутствие фермента регистрируют по изменению физического со­стояния субстрата (разжижение желатины), закислению пита­тельной среды (среды Гисса с углеводами), образованию опреде­ленных продуктов метаболизма (индол, сероводород, аммиак) и т.д.

Наиболее распространены следующие методы регистрации ферментативной активности микроорганизмов.

Выявление сахаролитической активности микроорганизмов. В со­став дифференциально-диагностических углеводных сред (среды Гисса — см. тему 7) входят различные соединения, которые можно условно назвать сахарами: моносахариды, полисахариды, много­атомные спирты. При утилизации углеводов в качестве конечных продуктов образуются кислоты и газообразные продукты. Соот­ветственно расщепление углевода регистрируют по изменению рН среды и выделению газообразных продуктов. Закисление пита­тельной среды улавливают при помощи различных индикаторов.

Индикатор BP, входящий в состав сухих сред Гисса, меняет цвет от розового в щелочной среде через серый при нейтральном рН до голубого или ярко-синего в кислой среде.

Индикатор Андрэдэ (кислый фуксин —0,5 г, 1%-й раствор гидроксида натрия — 16 мл, дистиллированная вода — 84 мл) при закислении дает покраснение среды. В жидких средах Гисса об­разование газов при утилизации субстрата улавливают при помо­щи поплавков («газовок») — стеклянных трубочек, запаянных в верхнем конце и помещенных в пробирки. В «газовках» скапли­ваются газы, вытесняющие жидкую питательную среду; в полу­жидких средах Гисса газообразные продукты остаются в толще среды в виде пузырьков.

Ферментация углеводов иногда происходит медленно, поэто­му предварительный учет результатов проводят через 24...48 ч, а окончательный — через 10...14 сут инкубирования посевов. Тест с метиловым красным показывает сте­пень закисления среды при расщеплении глюкозы. Метилрот как индикатор срабатывает в диапазоне рН 4,4...6,0. Исследуемую культуру выращивают 2...5 сут в жидкой среде Кларка с глюко­зой. Затем на 5 мл среды добавляют пять-шесть капель раствора метилрота. Положительный результат — покраснение среды пос­ле внесения индикатора (рН 4,0...5,0).

Среда Кларка: пептон — 5 г, гидрофосфат калия — 5 г, глюко­за — 5 г, вода дистиллированная — 1000 мл. Ингредиенты раство­ряют в воде, кипятят 2...3мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 6,9...7,0, разливают по пробиркам и стерилизуют при 112º С 20 мин.

Тест Фогес-Проскауера выявляет промежуточ­ный продукт расщепления глюкозы — ацетоин (ацетилметилкар-бинол, диметилкетон). Исследуемую культуру выращивают на среде Кларка. К 1 мл культуры добавляют 0,6 мл 5%-го раствора а-нафтола, перемешивают, вносят 0,2 мл 40%-го раствора гидро­ксида калия и инкубируют 1 ч. Положительная реакция — крас­ное окрашивание среды.

Выявление протеолитических и других ферментов микроорганиз­мов.Протеолитические ферменты расщепляют белки питательной среды до промежуточных (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или конечных (сероводород, индол, аммиак) продуктов.

Характер роста микроорганизма на мо­локе: при посеве исследуемой культуры бактерий на стериль­ное обезжиренное молоко можно выявить фермент, расщепляю­щий молочный сахар (лактозу), и протеолитические ферменты, действующие на молочный белок (казеин). Расщепление лактозы приводит к закислению и свертыванию молока, при выделении протеолитических ферментов казеин постепенно растворяется — пептонизируется, в результате чего молоко просветляется, при­обретает легкий кремовый оттенок, а на дне пробирки форми­руется осадок. Свертывание молока может также происходить под влиянием выделяемого некоторыми бактериями «сычужного» фермента, в этом случае реакция молока бывает щелочной. Иног­да возможна пептонизация казеина без свертывания молока.

Тест на гидролиз казеина в плотных питательных средах: обезжиренное молоко диализуют для удаления лактозы, которая ингибирует гидролиз казеина. В расплавленный питательный агар с двойной концентрацией агар-агара добавляют равный объем стерилизованного автокла-вированием диализованного молока. Исследуемую культуру бак­терий засевают «штрихом» на поверхность питательной среды, разлитой в чашки Петри. Посевы инкубируют до 14 сут. Перед учетом результатов поверхность среды заливают 10%-м раство­ром соляной кислоты. Положительный результат — просветле­ние среды вокруг колоний.

Тест на желатиназу: культуру микроорганизма за­севают уколом в столбик питательного бульона, содержащего 12 % желатины. После культивирования опытную и контрольную (незасеянную) пробирки охлаждают под холодной водой и по «текучести» желатины делают заключение о наличии фермента.

Тест на сероводород: узкие полоски фильтроваль­ной бумаги смачивают в 5%-м растворе ацетата свинца, высуши­вают, стерилизуют. Культуру микроорганизма засевают в пита­тельную среду в пробирке, после чего индикаторную бумагу по­мещают в пробирку (не должна касаться среды) и закрепляют пробкой. Выделяющийся сероводород реагирует с ацетатом свинца, и образующийся сульфид свинца вызывает почернение бумаги (положительный результат). Описанный метод выявления сероводорода при помощи индикаторных бумажек считают од­ним из наиболее чувствительных, разработаны и другие методы.

Тест на индол: исследуемую культуру целесообразно выращивать на средах, богатых триптофаном, при расщеплении которого образуется индол (бульон Хоттингера, бульон с 0,1% Z-триптофана). К выращенной культуре добавляют 1...3мл эфи­ра, встряхивают, отстаивают и вносят 0,5 мл реактива Эрлиха (парадиметиламинобензоальдегид — 1 г, 96%-й этанол — 95 мл, соляная кислота —20 мл). Через 5 мин учитывают результат. По­явление на границе эфира и питательной среды красно-фиолето­вого окрашивания свидетельствует о наличии индола.

Тест на аммиак: исследуемую культуру засевают в жидкую питательную среду в пробирке. Между пробкой и стен­кой пробирки закрепляют полоску розовой лакмусовой индика­торной бумажки. Посевы инкубируют в термостате 1...5сут. По­синение лакмусовой бумажки свидетельствует о выделении ам­миака.

Тест на уреазу: исследуемую культуру микроорганиз­ма засевают на среду Кристенсена (пептон — 1 г, хлорид на трия — 5 г, дигидрофосфат калия — 2 г, агар — 20 г, глюкоза — 1 г, 0,2%-й раствор фенолрота — 6 мл, 20%-й раствор мочевины — 100 мл, вода дистиллированная — 1000 мл) и выращивают 1...4сут. Положительный результат — покраснение среды в ре­зультате ее защелачивания.

Тест на редукцию нитратов выявляет восста­новление нитратов до нитритов. Культуру микроорганизма засе­вают в МПБ, содержащий 0,2 % нитрата калия, инкубируют 48...72 ч, затем в опытную и контрольную пробирки добавляют по 1 мл реактива с крахмалом (растворимый крахмал — 1 г, вода дистиллированная — 100 мл, йодид калия —0,5 г). К этому ра­створу перед постановкой реакции добавляют несколько капель 10%-го раствора соляной кислоты. Положительный результат— темно-синее окрашивание.

Тест на общую фосфатазу: исследуемую культу­ру микроорганизма засевают «штрихом» на поверхность пита­тельного агара с натриевой солью .дифосфата фенолфталеина, инкубируют 4...5 сут. Чашки переворачивают вниз крышкой, на внутреннюю поверхность которой наносят каплю 28...30%-го ра­створа нашатырного спирта. При наличии фосфатазы колонии приобретают красный цвет.

Тест на каталазу: бактериальную массу снимают с поверхности агара бактериологической петлей и суспендируют в капле 3%-го раствора перекиси водорода на предметном стекле. Положительный результат — образование пузырьков газа.

Тест на оксидазу: фильтровальную бумагу пропиты­вают 1%-м раствором тетраметилпарафенилендиамина дигид-рохлорида. Бактериальную массу петлей наносят на поверхность бумажной полоски. Положительный результат — фиолетовое или пурпурное окрашивание через 10...60 с.

Тест на редуцирующую способность бактерий (в метиленовом молоке) основан на следующей особенности: при окислительно-восстановительных реакциях у бактерий акцептором водорода может быть кроме молекулярного кислорода ряд органических красителей, которые, присоединяя водород, восстанавливаются и обесцвечиваются. Такие свойства отмечены у лакмусовой настойки, метиленового синего, малахи­тового зеленого и т. д. Например, молоко с метиленовым синим готовят так: молоко подщелачивают 10%-м раствором карбоната натрия до рН 7,2 и добавляют 20 мл 1%-го водного раствора ме­тиленового синего на 1000 мл. Готовая среда голубого цвета. Ре­зультат учитывают через сутки инкубирования посевов. В случае редукции красителя среда окрашена в кремовый цвет.

Тест-системы для быстрой идентифика­ции бактерий по группе специально отобранных биохи­мических признаков обычно представляют собой пластмассовые пластины с лунками (микропробирками), заполненными различ­ными сухими средами (субстратами). В эти среды вносят суспен­зию исследуемой культуры и после инкубирования учитывают результат. К тест-системам прилагают таблицы для учета резуль­татов и идентификации микроорганизмов в зависимости от спек­тра выявленных ферментов.

За рубежом разработаны тест-системы для идентификации энтеробактерий, анаэробов, несбраживающих бактерий и т. д. В России Нижегородский институт микробиологии и эпидемиоло­гии выпускает тест-систему подобного типа — биохимические пластины для идентификации энтеробактерий (ПБДЭ), кроме того, разработаны тест-системы для санитарно-микробиологи-ческих целей.

Принципы идентификации микроорганизмов. Основная задача бактериологического диагностического исследования — это оп­ределение таксономического положения выделенного микроор­ганизма путем сравнения его свойств со свойствами известных видов.

В рутинной бактериологической практике микроорганизм идентифицируют, изучая его фенотипические признаки (морфо­логические, тинкториальные, культуральные, биохимические, патогенные). Стали получать распространение некоторые мето­ды идентификации по генотипическим признакам (см. тему 12), которые ранее в основном применяли в научной работе для клас­сификации микроорганизмов с неясным таксономическим поло­жением.

В бактериологии для идентификации используют определите­ли микроорганизмов. Наиболее популярный — определитель бактерий Берджи — включает в себя описание свойств известных видов микроорганизмов. Бактерии в этом руководстве по огра­ниченному числу морфологических и физиологических призна­ков объединены в большие группы, например группа № 20 «Грамположительные неспорообразующие палочки неправиль­ной формы» или группа № 5 «Факультативно-анаэробные грам-отрицательные палочки». В пределах этих групп при помощи не­скольких дифференцирующих признаков бактерии подразделены на семейства, роды и виды. Распределение микроорганизмов в этом определителе не отражает иерархической классификации, а преследует сугубо практическую цель — как можно быстрее и экономичнее установить таксономическое положение изучаемо­го микроорганизма.

Идентификация неизвестного микроорганизма представляет собой процесс последовательного его отождествления с той или иной большой группой микробов, характеризующихся общими свойствами, затем с семейством в пределах группы, далее с тем или иным родом в пределах установленного семейства, и на ко­нечном этапе исследуемый микроорганизм отождествляют (идентифицируют) по совокупности морфологических, тинкто либо видом в пределах рода. В случае необходимости внутри вида устанавливают принадлежность культуры к био-, серо-, фаговару. Работа с определителем Берджи предполагает использование достаточно большого количества тестов, характе­ризующих различные свойства микроорганизма. В практических диагностических лабораториях, исходя из эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных, обычно проводят бактериологические исследования, заранее ориентированные на обнаружение возбудителя определенной инфекционной болезни, по схеме, предусмотренной официальной инструкцией.

 

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Ознакомиться с тестами, характеризующими ферментатив­ные свойства бактерий (ферментация углеводов в средах Гисса, образование индола, сероводорода; тесты на каталазу, оксидазу, желатиназу и т. д.).

. 2. Используя карточки с описанием свойств бактериальной культуры, при помощи определителя микробов установить ее ви­довую принадлежность.

3. Оценить результаты изучения ферментативной активности двух бактериальных культур семейства Enterobacteriaceae на ПБДЭ-пластинах и определить их вид при помощи прилагаемой дифференциальной таблицы.

Контрольные вопросы

1.Какое таксономическое значение имеет определение набора ферментов у микроорганизмов?

2.Что представляют собой современные тест-системы для изучения фермента­тивной активности микроорганизмов?

3.Что такое определители бактерий?

 

Тема 10

БАКТЕРИОФАГИ

Цель занятия. Ознакомить студентов с действием бактериофа­гов и их практическим использованием.

Оборудование и материалы. Культура вакцинного штамма L. monocytogenes, набор листериозных бактериофагов, стериль­ный МПБ, содержащий 0,5 % глюкозы, 2%-й МПА в чашках Петри, стерильные пипетки Пастера, лечебно-профилактичес­кий бактериофаг против паратифа и колибактериоза телят, чув­ствительная к фагу культура Е. coli.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Бактериофаги представляют собой вирусы, адаптировавшиеся в процессе эволюции к паразитированию в прокариотических клетках (рис. 47). Репродукция многих бактериофагов в клетке приводит к ее лизису. На специфической адаптации фагов к строго определенным видам (штаммам) бактерий и внешнем проявлении поражения бактериальных клеток (лизис) основано практическое использование бактериофагов: при помощи извес­тного (диагностического) фага можно обнаружить и идентифи­цировать бактерии. Кроме того, биологическая промышленность выпускает лечебно-профилактические бактериофаги.

Определение литической активности бактериофага. У диагнос­тических и лечебно-профилактических фагов должна быть выра­жена литическая активность, которую определяют путем титро­вания фагов, например, в жидкой питательной среде.

В бактериологические пробирки разливают по 4,5 мл стериль­ного МПБ; в первую пробирку вносят 0,5 мл исследуемого фага, затем готовят его десятикратные разведения от 10~' до Ю-'0. К разведениям бактериофага добавляют по капле суточной бульон­ной культуры чувствительного к данному фагу вида бактерий, инкубируют при 37 °С 24 ч. За титр фага принимают его макси­мальное разведение, еще способное вызвать лизис бактерий — среда в пробирке прозрачна. Фаг считают активным при титре 10-7, 10-8

Рис. 47. Схема строения фага Т2 по данным электронной микроскопии: а — с нуклеиновой кислотой в головке: 1 — головка; 2— полая центральная часть; 3 — оболочка (расправленная); 4— базальная пла­стинка; б —без нуклеиновой кислоты в го­ловке: I — головка; 2 — оболочка (сокрашенная); 3 — хвостовые нити

Определение количества бактериофага (по методу Грациа). Го­товят десятикратные разведения исследуемого фага в физиологи­ческом растворе (10-1…10-2 и т.д.), затем из последнего разведе­ния, например 10-7 или 10-8, берут 0,5 мл жидкости, смешивают с равным объемом чувствительной к данному бактериофагу буль­онной культуры бактерий. Полученную смесь добавляют к 4 мл расплавленного 0,7%-го МПА (температура 45 °С), перемешива­ют и выливают на поверхность подсушенного питательного агара в чашку Петри. Аналогичным образом поступают со всеми разведениями бактериофага (10-5, 10-5 и т.д.). Чашки инкубируют в термостате при 37 ºС 24 ч.

 

 

 

Учет результатов: не пораженные бактериофагом бактерии ра­стут и образуют сплошной газон на поверхности питательного агара. Клетки, пораженные фагом, лизируются, и в этой зоне можно видеть «стерильные» пятна на сплошном бактериальном газоне. Количество этих пятен («бляшек») соответствует количе­ству фаговых частиц в суспензии (рис. 48).

 

 

Применение фагов для идентификации бактерий. Фаги приме­няют для видовой идентификации бактерий (возбудитель сибир­ской язвы, листериоза и др.) или внутривидовой — установление фаговара конкретного бактериального штамма.

Для идентификации неизвестной культуры бактерий при по­мощи диагностического бактериофага обычно используют плот­ную питательную среду. Например, исследуемую 18-часовую культуру, предположительно листерий, засевают в МПБ с глюко­зой, инкубируют при 37 °С 4 ч до легкой опалесценции среды и затем засевают газоном (0,1мл) на подсушенный 2%-й МПА в чашку Петри. Через 1... 1,5 ч инкубирования посевов при 37 ºС при слегка приоткрытой крышке на одну половину газона нано­сят каплю листериозного бактериофага 2А и на вторую половину помещают каплю фага 4А. Посевы инкубируют при 22...25 °С 16...24ч.

Учет результатов: если культура листериозная, то на месте нане­сения хотя бы одного фага можно видеть прозрачную зону лизиса.

Для установления фаговара исследуемую культуру проверяют с набором типовых фагов, охватывающих все фаговарианты дан­ного вида бактерий, определяют, к какому фагу чувствителен данный штамм, что и служит его маркером.

 

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Определить активность лечебно-профилактического коли-па-ратифозного фага по отношению к исследуемой культуре Е. coli.

2. Провести идентификацию культуры L. monocytogenes при помощи листериозных диагностических фагов.

Контрольные вопросы

1.Что такое бактериофаг?

2.Как используют бактериофаги?

3.Какими методами титруют бактериофаги?

 

Тема 11






Дата добавления: 2016-07-22; просмотров: 4255; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ


Поиск по сайту:

Воспользовавшись поиском можно найти нужную информацию на сайте.

Поделитесь с друзьями:

Считаете данную информацию полезной, тогда расскажите друзьям в соц. сетях.
Poznayka.org - Познайка.Орг - 2016-2022 год. Материал предоставляется для ознакомительных и учебных целей.
Генерация страницы за: 0.054 сек.