ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель занятия. Ознакомить студентов с типами питательных сред, методами их конструирования и культивированием микро­организмов.

Оборудование и материалы. Агар-агар, пептон, желатина, мяс­ная вода, перевар Хоттингера, МПА, МП Б, среды Китта—Тароцци, Эндо, Левина, Вильсон—Блера, Гисса, сухие питательные среды, кровяной МПА, потенциометр, индикаторные бумажки, стерильная дефибринированная кровь барана, термостат, анаэростат.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К любой питательной среде предъявляют ряд основных требо­ваний: 1) стерильность и по возможности прозрачность; 2) со­держание необходимых для жизнедеятельности клеток биохими­ческих факторов — источников энергии, углерода, азота, серы, а также неорганических ионов — обязательно в форме, доступной для усвоения микроорганизмами; 3) оптимальные значения ряда биофизических показателей: концентрации водородных ионов (рН), окислительно-восстановительного потенциала (Eh), актив­ности воды (a_W), осмотического давления.

Концентрация водородных ионов (рН). Микроорганизмы способны существовать в строго определенных границах кислотности питательной среды. В зависимости от кислотного оптимума бактерии подразделяют на нейтрофилы, алкалофилы и ацидофилы.

Вода слабо диссоциирует, поэтому концентрация ионов водорода Н+ (реально существуют ионы Н₉O₄⁺ — гидратированная форма иона гидроксония Н₃О⁺) и гидроксид-ионов ОН^- в чистой воде при 25 °С составляет 10^-7 моль/г. Преобладание в растворе водородных ионов определяет его кислую реакцию, гидроксильных — ще­лочную, при равной концентрации ионов Н⁺ и ОН^- раствор нейтрален. Произве­дение концентраций водородных и гидроксильных ионов в конкретном растворе всегда равно постоянной величине (константе), которую называют ионным произ­ведением воды: К = (Н^-7)(ОН^-7) = 10^-14. Следовательно, чтобы судить о реакции среды, достаточно определить концентрацию только одного из указанных ионов. Обычно определяют концентрацию ионов водорода. Вместо концентрации ионов водорода указывают ее десятичный логарифм, взятый с обратным знаком, называ­ют эту величину водородным показателем и обозначают символом рН = -lg (Н+). Измеряют рН питательных сред потенциометрическим (электрометрическим) или колориметрическим способами.

Последовательность операций при определении рН на иономере И-130 приве­дена далее. (Показания стеклянного электрода предварительно калибруют по буфе­рам с точно известными значениями рН.)

1. Прибор включают в сеть и прогревают в течение 30 мин.

2. Так как температура раствора влияет на результат определения рН, на штативе устанавливают термометр или автоматический термокомпенсатор. Переключатель рода термокомпенсации на передней панели переводят в соответствующее по­ложение.

Стаканчик предварительно ополаскивают анализируемым раствором, элект­роды промывают дистиллированной водой и также ополаскивают анализируемым раствором, подсушивают фильтровальной бумагой.

Анализируемый раствор наливают в стаканчик, в который погружают элект­роды. Время снятия показаний не более 3 мин.

После окончания измерений электроды промывают дистиллированной во­дой и погружают в стаканчик с дистиллированной водой.

При колориметрическом определении используют индикаторы. Все индикато­ры представляют собой слабые кислоты или основания, и их диссоциация в раство­ре зависит от концентрации водородных ионов. Недиссоциированная молекула индикатора и его ионы разного цвета. Внося индикатор в раствор с неизвестной концентрацией водородных ионов, сопоставляют его цвет в исследуемом растворе с цветом раствора с известным значением рН. Грубую оценку рН (±0,2) проводят с помощью бумажных индикаторов, к которым приложена цветовая шкала: каждая цветная полоса на бумажной карточке соответствует определенному значению рН. Универсальный индикатор изменяет окраску в диапазоне рН от 2 до 10.

Большинство бактерий растут в питательных средах со слабощелочными значе­ниями рН (6,8...7,6), грибы — в кислых средах (рН 3,0...6,0). рН среды доводят до нужного значения дробным внесением слабых растворов щелочи, 10%-го раствора соды или кислоты. Например, надо приготовить 1000 мл МПБ с рН 7,4. При стери­лизации сред рН обычно снижается приблизительно на 0,2, поэтому перед стери­лизацией рН среды доводим до 7,6. Для этого к 40 мл МПБ с исходным значением рН добавляем 4 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия. Следовательно, на 1000 мл МПБ необходимо добавить в 25 раз больше раствора щелочи (100 мл).

В процессе роста микроорганизмов на питательных средах кислотность доста­точно быстро может выйти за пределы оптимальной. Чтобы поддержать необходи­мое значение рН, в среды нередко добавляют фосфатные буферные смеси. При вы­ращивании микроорганизмов в реакторах рН среды корректируют периодическим добавлением раствора щелочи или кислоты.

Окислительно-восстановительный потенциал (ОКВП, Eh). Рост микроорганиз­мов тесно связан с окислительно-восстановительными условиями питательной среды, которые влияют на работу окислительно-восстановительных систем мик­робных клеток. ОКВП принято отсчитывать относительно окислительно-восста­новительного потенциала водорода H₂↔2Н⁺+2е Стандартное значение потенци­ала этой реакции при рН 7,0 (Е₀) составляет —420 мВ. Большое отрицательное зна­чение стандартного ОКВП водорода характеризует его высокую восстановительную способность, т. е. способность отдавать электроны. Стандартный ОКВП системы Н₂0↔1/2 О₂+ 2Н⁺ + 2е равен 820 мВ. Большое положительное значение потенци­ала в данном случае объясняет низкую способность воды отдавать электроны и од­новременно высокую способность молекулярного кислорода акцептировать элект­роны. ОКВП можно измерять электрометрическим способом. В этом случае ис­пользуют электрод измерения и электрод сравнения, потенциал последнего по от­ношению к стандартному водородному электроду известен. ОКВП системы по отношению к водороду обозначают как Eh. Измеряют Eh питательной среды, на­пример, при помощи иономера И-130.

Прибор включают в сеть и прогревают 30 мин.

Переключатель рода работ переводят в положение «V».

Погружают электроды в стакан с раствором, при этом следят, чтобы электрод сравнения был установлен на несколько миллиметров ниже измерительного.

После установления показаний их снимают в мВ.

Для корректировки ОКВП питательных сред в них добавляют различные веще­ства (см. «Культивирование анаэробных бактерий» в данной теме).

В питательных средах повышение ОКВП в основном связано со степенью на­сыщения кислородом. Аэробы хорошо растут при высоких положительных значе­ниях Eh, рост большинства анаэробов прекращается при Eh, выше —100 мВ, а стро­гих анаэробов — при Eh превышающем —330 мВ.

О значении Eh также можно судить по цвету окислительно-восстановительных красителей, которые окрашены в окисленном состоянии и бесцветны в восстанов­ленном. Различные красители восстанавливаются при разных значениях Eh, поэто­му подбором красителей можно контролировать ОКВП питательных сред. Значе­ние Eh, при котором краситель окислен или восстановлен на 50 % при рН 7,0, на­зывают стандартным ОКВП (Е₀). Например, для метиленового синего Е₀ составля­ет 11 мВ, резоруфина - 51 мВ, феносафранина - 252 мВ.

Активность воды и осмотическое давление. Микроорганизмы поглощают пита­тельные вещества в виде растворов, поэтому вода — абсолютно необходимый ком­понент любой среды. Минимальная предельная влажность питательной среды для роста бактерий составляет 20...30 %, грибов — 15%. Однако вода в питательной среде частично связана с растворенными в ней веществами и поэтому недоступна для микроорганизмов. Содержание воды в доступной для микробов форме выра­жают показателем активности воды (а„), которую определяют как отношение дав­ления водяного пара над питательной средой (раствором) к давлению паров над чистой водой (Р/Р₀)- У дистиллированной воды a_w = 1,0. Бактерии растут в средах с _0w = 0,95...0,99. Активность воды в среде можно определить по формуле а_w = A/100, где А — относительная влажность (%) атмосферы, которую измеряют при равнове­сии в закрытом сосуде, содержащем питательную среду.

Существенное отклонение осмотического давления питательной среды от оп­тимального тормозит рост бактерий. Именно по этой причине соль и сахар в высо­ких концентрациях используют для консервирования пищевых продуктов. Среди болезнетворных бактерий только некоторые виды способны расти при повышен­ных концентрациях хлорида натрия в питательной среде (стафилококки, листерии). Наиболее доступный способ достижения оптимальных значений осмотичес­кого давления и активности воды в бактериологических питательных средах — это добавление в них хлорида натрия (0,5 %) или некоторых других солей.