ГЕНЕТИКА И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель занятия. Ознакомить студентов с фенотипической и генотипической изменчивостью и генетическими методами иден­тификации микроорганизмов.

Оборудование и материалы. Культура Proteus vulgarus, пробирки с 2%-м МПА, 1%-й раствор фенола, пробирки с 10 мл и с 1 мл МПБ, чашки Петри с 3%-м МПА, содержащим 100 ЕД стрепто­мицина в 2 мл среды, чашки Петри с обычным МПА, стерильные мерные пипетки на 1 мл, диссоциирующая культура Е. coli или P. multocida на МПА в чашках Петри в виде изолированных коло­ний, бинокулярная лупа МБС-1, культура Е. coli, продуцирующая колицин, и колицинчувствительная культура Е. coli, чашки Пет­ри с 1,5%-м МПА, хлороформ, пробирки с 0,7%-м МПА, штам­мы Е. coli K12F-, lew, strr, Е. coli К12 Hfr, leu+, strs, E. coli lac^-, трансдуцирующий фаг λ dgal, содержащий β-галактозидазный оперон Е. coli; набор компонентов для ПЦР-диагностики какой-либо инфекционной болезни, амплификатор.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Генетика микроорганизмов. Природа изменений свойств мик­роорганизмов может быть наследственной (генотипической) и ненаследственной (модификационной, фенотипической).

Модификационная изменчивость. В отличие от мутаций затра­гивает сразу большое количество клеток в популяции.

Модификации — это ненаследуемые фенотипические измене­ния, которые возникают под влиянием различных факторов, но после прекращения их действия исчезают. При этом клетки с одинаковым генотипом могут различаться по фенотипу.

Генотипическая изменчивость. Может быть мутационной, обусловленной изменениями в ДНК под влиянием мутагенов, и комбинативной, связанной с процессом образования новых ком­бинаций генов в генотипе.

Мутации проявляются фенотипически в виде изменения какого-либо признака, присущего микроорганизму, — физиологи­ческого, морфологического. Различают индуцированные и спон­танные мутации. Последние возникают под влиянием неустанов­ленных факторов и достаточно редки в популяции (1 • 10^-5...1*10^-7).

Рекомбинации — обмен генетическим материалом между двумя бактериальными клетками. Клетку, воспринимаю­щую генетический материал, называют реципиентом, отдаю­щую — донором. Рекомбинантные клетки содержат в составе своего генома фрагменты хромосомы донора. Механизм проник­новения донорской ДНК в клетку реципиента может быть разли­чен: 1) трансформация — «голая» ДНК проникает в клетку реци­пиента без взаимного контакта клеток; 2) трансдукция — перенос фрагментов ДНК из клетки донора в реципиентную клетку уме­ренным бактериофагом; 3) конъюгация — перенос фрагмента ДНК при непосредственном контакте клеток донора и реципи­ента. В процессе конъюгации из одной клетки в другую может переходить плазмидная ДНК. Плазмида (F-фактор) представляет собой внехромосомные небольшие кольцевые молекулы ДНК разной длины. Плазмиды обычно обозначают по характерному свойству клетки-хозяина: R-фактор — плазмида, обеспечиваю­щая устойчивость к лекарственным препаратам, Соl-фактор — плазмида, детерминирующая синтез клеткой антибиотикоподоб-ных веществ (колицинов, бактериоцинов) и т. д.

Выявление модификационной изменчивости. В пробирку с 6 мл расплавленного МПА добавляют 0,6 мл 1%-го раствора фенола, агар скашивают. В пробирки с фенолизированным и обычным МПА засевают культуру Proteus vulgaris по методу Шукевича в конденсационную воду. Посевы инкубируют при 37...38 °С 24 ч и учитывают характер роста протея на фенолизированном и обыч­ном МПА. На фенолизированном агаре протей в отличие от обычного МПА не проявляет феномена «роения».

Выявление мутационной изменчивости во флуктуационном тес­те Лурия—Дельбрюка. Данный тест используют для изучения природы возникновения различных свойств у бактерий: устойчи­вости к бактериофагу, лекарственным препаратам, способности расщеплять углеводы и т. д. В соответствии с гипотезой адапта­ции каждая клетка в популяции в присутствии того или иного фактора — фага, антибиотика и т. д. — может с некоторой долей вероятности приобрести устойчивость к нему (адаптироваться). Согласно гипотезе спонтанных мутаций каждая клетка бактерий также с небольшой долей вероятности может приобрести устой­чивость к тому или иному фактору в результате мутаций незави­симо от присутствия этого фактора в среде обитания.

С помощью флуктуационного теста Лурия—Дельбрюка можно подтвердить мутационную природу возникшего свойства.

Готовят два ряда культур.

1. «Параллельные» культуры: в пробирку, содержащую 10 мл МПБ (обозначим ее № 1), и в 10 пробирок, содержащих по 1 мл МПБ (№2...11), одновременно высевают одинаковое количество клеток Е. coli (300...500 бактериальных клеток на пробирку). По­севы инкубируют при 37 °С 24 ч.

2. «Независимые» культуры: в 20 чашек Петри разливают МПА с добавлением стрептомицина (конечная концентрация антибиотика 100 ЕД на чашку). Первые 10 чашек засевают по 0,1 мл культурой, взятой из пробирки № 1; следующие 10 чашек засевают по 0,1мл культурами, взятыми из пробирок №2...11. Посевы инкубируют при 37 ºС 24 ч. После инкубирования под­считывают число выросших колоний на всех чашках Петри с «параллельными» и «независимыми» культурами.

На стрептомициновом агаре давать колонии могут только ус­тойчивые к стрептомицину клетки Е. coli.

Примерно одинаковое число колоний на всех чашках (нет статистически достоверных отличий) подтверждает теорию адап­тации. Если же на чашках, засеянных культурами из пробирок №2...11, наблюдают существенную разницу в числе колоний, а на чашках, засеянных культурой из пробирки № 1, нет статисти­чески достоверных отличий, то можно говорить о мутационной природе наблюдаемой стрептомицинустойчивости. Мутации — редкое событие, и при посеве из отдельных пробирок мутанты вырастают только в некоторых чашках. При посеве же из общей пробирки предсуществующие мутанты будут равномерно распре­делены в жидкой среде и соответственно в чашках с агаром.

Диссоциация бактерий.Диссоциация — это появление в бакте­риальной популяции колоний различного типа: S-формы (smooth — гладкий), R-формы (rough — шероховатый), что может быть следствием мутаций или рекомбинаций.

Для бактерий в S-форме характерны типичные для вида морфо­логические, ферментативные и вирулентные свойства. У R-формы обычно отмечают меньшую вирулентность, потерю способности к капсулообразованию, нередко изменение ферментативных свойств. Анализ популяции бактериальных штаммов по признаку диссоциации с целью отвивки (селекции) S-формы — обязатель­ный этап при работе с производственными штаммами. В ходе та­кой селекции ориентируются на морфологические и оптические характеристики S- и R-колоний.

Для анализа популяции бактерий с признаками диссоциации (Е. coli, P. multocida) производят дробный рассев исследуемой культуры на МПА в чашки Петри с целью получения изолиро­ванных колоний. Посевы культивируют при 37...38 °С 18...24 ч. Чашку Петри с колониями помещают на предметный столик би­нокулярной лупы и изучают в косопроходящем пучке света (см. тему 8).

Дополнительно из колоний S- и R-формы делают окрашен­ные мазки и изучают особенности морфологии клеток.

Выявление бактериальной плазмиды Со1+ (по методу отсрочен­ного антагонизма Фредерик). Исследуемую культуру Е. coli засева­ют уколом в 1,5%-й МПА (обычно 6...8 штаммов на одну чашку). Посевы инкубируют при 37 °С 48 ч. Выросшие колонии убивают парами хлороформа, затем поверхность агара заливают слоем расплавленного и охлажденного до 46...48 ºС 0,7%-го агара, сме­шанного с 0,1 мл 6-часовой бульонной культуры Е. coli, чувствительной к колицинам. Через 24 ч инкубирования при 37 ºС вок­руг колоний, продуцирующих колицин, можно видеть зоны по­давления роста колицинчувствительной (индикаторной) куль­туры.

Демонстрация специфической трансдукции. Для проведения опыта необходимы: реципиентный штамм Е. coli lac^-, не способ­ный ферментировать лактозу, трансдуцирующий фаг λ dgal, ге­ном которого содержит β-галактозидазный оперон Е. coli.

Смешивают 1 мл 3-часовой бульонной культуры Е. coli и 1 мл фага с титром 10^-6...10^-7, смесь инкубируют при 37 °С 1 ч. Затем из смеси готовят десятикратные разведения в пробирках. Из про­бирки с разведением 10^-6 высевают в три чашки Петри с агаром Эндо по 0,1мл культуры. Посевы инкубируют при 37 ºС 24 ч. Подсчитывают лактозонегативные и лактозопозитивные (транс -дуктанты) колонии. Соотносят число трансдуктантов к числу ко­лоний реципиентного штамма (светлые, лактозонегативные ко­лонии) и определяют таким образом частоту трансдукции. На­пример, выросло 6 колоний красного цвета (трансдуктанты) и 468 светлых колоний (реципиентные), следовательно, частота трансдукции составляет 6/468 = 1,3 * 10^-2.

Демонстрация конъюгации. Для проведения опыта необходи­мы: реципиентный штамм Е. coli K12F^-, leu^-, Str^r; донорский штамм Е. coli К12, Hfr, leu+, Str^s; минимальная синтетическая сре­да для обнаружения рекомбинантов (сульфат железа — 0,0005 г, глюкоза — 2 г, сульфат аммония — 1 г, сульфат магния — 1 г, ди-гидрофосфат калия —6,5 г, нитрат кальция — 0,001 г, стрептоми­цин — 200 ЕД/мл, вода дистиллированная — 1000 мл), аналогич­ная питательная среда без стрептомицина; полноценный пита­тельный агар со стрептомицином.

В пробирке объединяют 3-часовые бульонные культуры реци­пиентного и донорского штаммов в соотношении 2:1, смесь вы­держивают при 37 °С 30 мин, разводят стерильным физиологи­ческим раствором в соотношении 1 : 100 и по 0,1 мл высевают на минимальную селективную среду (агаровую). Посевы инкубиру­ют при 37 °С 18...20 ч, затем учитывают рост колоний эшерихий. На этой среде могут расти только клетки рекомбинантов, соеди­нившие в себе устойчивость к стрептомицину (свойство реципи­ента) и отсутствие зависимости от лейцина (свойство донора). Для отрицательного контроля на минимальную селективную сре­ду высевают культуры донорского и реципиентного штаммов (не должны расти). Для положительного контроля донорский штамм высевают на селективную среду без стрептомицина, а реципиен­тный штамм — на полноценный питательный агар со стрептоми­цином (эшерихий должны расти на обеих средах).

Если определить количество жизнеспособных клеток реципи­ентов в посевном материале и соотнести их с количеством рекомбинантных клеток, то можно рассчитать частоту рекомбина­ции (см. «Демонстрацию специфической трансдукции»).

Генетические методы идентификации микроорганизмов. Фенотипические признаки бактерий отражают максимум 20 % геноти­па, поэтому ученые интенсивно разрабатывают методы и крите­рии идентификации микроорганизмов, основанные на изучении не фенотипического проявления генома, а особенностей строе­ния ДНК.

Сравнение геномов по составу основания ДНК.ДНК содержит четыре азотистых основания: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г), цитозин (Ц). По правилам спаривания оснований А = Т и Г = Ц, но молярное отношение (Г + Ц): (А + Т) варьирует у разных ви­дов и может служить таксономической характеристикой.

Поскольку число водородных связей между основаниями в парах ГЦ больше, чем между основаниями в парах AT, то о ГЦ-содержании судят по «температуре плавления» ДНК, т. е. по тем­пературе, при которой происходит разрыв водородных связей, со­единяющих цепи ДНК. Разделению цепей сопутствует увеличение оптической плотности, которую измеряют спектрофотометром при А = 260 нм (максимум поглощения ДНК). По мере нагревания образца ДНК поглощение возрастает и, когда ДНК становится одноцепочечной, кривая поглощения достигает плато.

У каждого бактериального вида ДНК содержит характерное среднее количество ГЦ, и если нуклеотидный состав ДНК у двух сравниваемых микроорганизмов существенно отличается(10...15 %), то говорят об их принадлежности к различным таксо­номическим группам. Однако отсутствия существенных отличий в количестве ГЦ у двух видов бактерий недостаточно для заклю­чения о тождестве этих бактерий: необходимо доказать высокое фенотипическое сходство обоих видов или применить другие ге­нетические методы.

Метод гибридизации нуклеиновых кислот. Основан на том, что одноцепочечная ДНК после тепловой денатурации при пониже­нии температуры на 20...30 °С ниже температуры плавления спо­собна реассоциироваться (отжиг) в изначальную двухцепочечную ДНК. Также был установлен факт реассоциации одноцепочечных ДНК от различных видов бактерий с образованием гибрид­ной ДНК, причем чем больше гомология сравниваемых одноцепочечных ДНК, тем успешнее реассоциация. Аналогичным обра­зом можно проводить гибридизацию между РНК и ДНК, тРНК и рРНК.

При проведении гибридизации ДНК один из сравниваемых образцов денатурированной ДНК метят радиоактивным изото­пом, образовавшиеся двухцепочечные ДНК отделяют от одноцепочечных и измеряют их радиоактивность. В качестве контроля используют меченую и немеченую ДНК эталонного (известного) штамма микроорганизма. Степень реассоциации таких гомоло­гичных одноцепочечных ДНК принимают условно за 100%. Су­ществует точка зрения, что при 60... 100 % гомологии ДНК можно говорить о принадлежности сравниваемых бактерий к одному виду, при 40...60 % — к одному роду, при 0...25 % гомологии — к родам одного семейства и разным семействам.

Метод генных зондов. Используют достаточно часто для идентификации бактерий. От обычной ДНК—ДНК гибридиза­ции этот способ отличается использованием не тотальной ДНК, а определенного ее фрагмента (зонда), содержащего из­вестный ген (генетический маркер). Предварительно создают «банк генов» изучаемой бактерии. С этой целью бактериаль­ную ДНК расщепляют эндонуклеазами, фрагменты ДНК раз­деляют электрофоретически, методом трансформации опреде­ляют их генетические характеристики, отбирают нужный фрагмент ДНК и при помощи лигазы включают в плазмиду, которая служит вектором. Плазмиду с интегрированным изве­стным геном вводят в какой-либо бактериальный штамм, обычно достаточно легко культивируемый. Получают большое количество биомассы, содержащей ДНК-зонд. Выделяют плазмидную ДНК, метят ее радиоактивным изотопом, затем эту меченую ДНК гибридизируют с ДНК изучаемой бактерии. Ме­тодом ауторадиографии выявляют относительную частоту гиб­ридизации маркера с изучаемой ДНК и по этому показателю судят о генетическом родстве известной (бактерии — донора ДНК) и исследуемой бактерий.

Полимеразная цепная реакция — ПЦР (polymerase chain reaction — PCR). Принцип реакции состоит в том, что при помо­щи ДНК-полимеразы in vitro многократно синтезируют копии определенного участка ДНК (амплификация — накопление).

ПЦР — циклический процесс, каждый цикл которого включа­ет в себя три стадии.

1. Проводят тепловую денатурацию (95 °С) исследуемой ДНК. При этом разрушаются водородные связи, соединяющие парные основания, и цепи ДНК расходятся, т. е. образуются одноцепо-чечные ДНК, которые доступны для праймеров (затравок) и ДНК-полимеразы. Длительность процесса 1 мин.

2. Осуществляют посадку (отжиг) праймеров на комплемен­тарные участки двух антипараллельных цепей ДНК. Праймеры представляют собой два синтетических олигонуклеотида длиной в 20...30 нуклеотидов, каждый из которых комплементарен про­тивоположной цепи ДНК в участках, ограничивающих выбран­ный сегмент ДНК возбудителя. Таким образом, праймеры огра­ничивают специфический для возбудителя участок ДНК. Прай­меры добавляют в реакционную смесь в избытке, что позволяет им занять свои комплементарные участки до того, как произой­дет соединение (ренатурация) одноцепочечных ДНК в двухцепо-чечную. Длительность стадии 1...2мин.

3. Идет процесс достройки (элонгации) праймера из вне­сенных в реакционную смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов при участии ДНК-полимеразы. Используют обычно термоста­бильную ДНК-полимеразу термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимераза), что позволяет вести полимериза­цию при оптимальной температуре 70...75 °С. При синтезе ДНК праймеры включаются в ее молекулу. Синтез ДНК с по­мощью полимеразы протекает только между праймерами, и при этом удваивается число копий именно этого участка ДНК. Молекула ДНК, синтезированная при помощи одного прайме­ра, может служить матрицей для синтеза комплементарной ДНК при помощи другого праймера. Длительность этой ста­дии 1...2 мин (рис. 50).

По завершении 1-го цикла реакцию тормозят и ДНК вновь подвергают температурной денатурации. При охлаждении избы­точные праймеры опять гибридизируются с цепями исходной и вновь синтезированной ДНК. Добавление ДНК-полимеразы обеспечивает второй цикл полимеризации. Таким образом мож­но провести несколько десятков циклов ферментативного удли­нения праймеров, в результате количество сегментов ДНК, огра­ниченных с обеих сторон праймерами, с каждым циклом увели­чивается экспоненциально. Следовательно, используя метод ПЦР, можно in vitro избирательно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в миллион раз и более. Факт увеличения числа фрагментов ДНК служит доказательством присутствия в исследуемом образце гомологичной ДНК, т. е. возбудителя инфекционной болезни.

Для практического использования ПЦР необходимо синтези­ровать праймеры, комплементарные З'-концам цепей копируе­мой ДНК-матрицы и ограничивающие копируемый фрагмент ДНК. Их выбирают на основе участков генома возбудителя с рас­шифрованной нуклеотидной последовательностью и устойчивых к генетическим перестройкам. Например, для идентификации C.psittaci были предложены праймеры, выбранные на основе гена, кодирующего белок наружной мембраны, или на основе гена, кодирующего 16s рРНК; для идентификации бруцелл был выбран праймер на основе гена, кодирующего белок внешней мембраны 31 КДа, и т. д.

Для проведения ПЦР-диагностики необходимы следующие компоненты: водные растворы дезоксинуклеозидтрифосфатов четырех типов (gATO, gTTO, glTO, gHTO, 10 мМ, рН 7,0); пер­вый праймер (5 мМ); второй праймер (5 мМ); фермент Taq-поли-мераза (5 ЕД/мкл); амплифицируемая ДНК (~ 1 мкг); ионы Mg2+ для обеспечения работы полимеразы (25 мМ); буферный раствор (десятикратный концентрат), например, трис-соляная кислота (рН 6,8...7,8) с добавлением бычьего альбумина и неионных де­тергентов.

Указанные компоненты объединяют в пробирке, например, в следующих количественных соотношениях: раствор дезоксинук­леозидтрифосфатов — 8 мкл, буфер—10мкл, амплифицируемая ДНК — ~ 1 мкг, праймеры — по 1...5 мкл, полимераза — 0,5 мкл, дистиллированная вода — до 100 мкл. Для предотвращения испа­рения на жидкость в пробирке наслаивают минеральное масло. На первом этапе проведения ПЦР денатурируют ДНК, затем в реакционную смесь, содержащую дезоксинуклеозидтрифосфаты, вносят полимеразу и помещают в амплификатор или термоцик-лер (программируемый термостат). Амплификацию проводят в термоциклере по заданной программе, например: 90 "С — 1 мин; 60 °С - 1 мин; 72ºС - 1 мин (5 циклов); 93 °С - 1 мин; 57 °С -1 мин; 92 °С — 1 мин (5 циклов); 93 °С — 1 мин; 55 °С — 1 мин; ,72 °С — 3 мин (25 циклов).

После завершения амплификации следует этап обнаружения продуктов ПЦР — амплификонов. Молекулы ДНК и их фрагмен­ты разделяют электрофорезом в агаровом геле. ДНК в геле окра­шивают бромидом этидия с последующим анализом и фотогра­фированием фореграмм при ультрафиолетовом облучении. Спе­цифичность полосы амплифицированной ДНК подтверждают сравнением с маркерными фрагментами и ДНК-стандартом. До­полнительно специфичность амплификона можно подтвердить путем гибридизации со специфическим радиоактивным зондом.

Объектом исследования в ПЦР могут служить как ткани, со­держащие возбудитель, так и культуры возбудителя. Из материа­ла обычно тем или иным способом извлекают ДНК. В зависимо­сти от характера материала методы его обработки варьируют.

Ценность ПЦР-диагностики возрастает, когда необходимо обнаружить возбудителей инфекционных болезней, или трудно культивируемых, или находящихся в нетипичной форме (L-формы бактерий), а также выявить гены, контролирующие тот или иной фактор патогенности микроорганизма.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Изучить и охарактеризовать рост культуры протея на обыч­ном и фенолизированном МПА.

2. Определить природу возникновения стрептомицинрезистентных форм Е. coli по результатам флуктуационного теста Лурия—Дельбрюка.

3. Ознакомиться с диссоциацией бактерий. Описать особен­ности морфологии S- и R-колоний и бактериальных клеток из них.

4. Ознакомиться с бактериоциногенией (способность выде­лять антибиотикоподобные вещества) на примере колицинов Е. coli.

5. Проанализировать результаты опытов по конъюгации,
трансдукции и трансформации бактерий.

6. Изучить схему проведения ПЦР, реагенты, аппаратуру.

Контрольные вопросы

1.Какие известны формы изменчивости бактерий?

2.В чем состоит тест Лурия—Дельбрюка?

3.Какова роль плазмид в формировании патогенных свойств бактерий?

4.Какие генотипические методы применяют для идентификации бактерий?

Раздел II

ИНФЕКЦИЯ И МЕТОДЫ ПРИКЛАДНОЙ ИММУНОЛОГИИ

•

Тема 13