Определение активности дегидрогеназы в почве

Дегидрогеназы – ферменты, участвующие в процессе дыхания, они отщепляют водород от окисляемых субстратов. Дегидрогеназы распространены очень широко. Основным методом обнаружения дегидрогеназ является восстановление индикаторов с низким редокспотенциалом типа метиленовой сини за счет дегидрирования соответствующих субстратов.

Для определения активности дегидрогеназ почвы в качестве акцептора водорода применяют бесцветные соли татразолия, которые восстанавливаются в красные соединения формазанов (трифенилформазан, ТФФ).

Ход работы

Навеску воздушно-сухой почвы 1 г помещают в пробирку, добавляют 10 мг СаСО₃, 1 мл 0,1 М раствора глюкозы и 1 мл 1%-ного раствора ТТХ и тщательно смешивают. Пробирки помещают в анаэростат и после создания вакуума инкубируют при 30⁰С в течение 24 ч. По истечении срока инкубации образовавшийся ТФФ экстрагируют этанолом (25 мл) и фильтруют.

Окрашенный раствор фотокалориметрируют с синим светофильтром при длине волны 540 нм. Количество формазана в миллиграммах рассчитывают по стандартной кривой.

Для составления калибровочной кривой готовят стандартный раствор формазана в этиловом спирте (0,1 мг в 1 мл), затем в мерные колбы на 25 мл берут соответствующее количество стандартного раствора, содержащее от 0,1 до 1,0 мг формазана, этанолом доводят до метки и фотокалориметрируют. Активность дегидрогеназы выражают в мг ТФФ на 10 г почвы за сутки. Ошибка определения – до 8%.

Определение активности инвертазы в почве

Инвертаза гидролизует сахарозу на глюкозу и фруктозу, разрывая связь, находящуюся у β-глюкозидного углеродного атома остатка фруктозы в молекуле сахарозы. Она действует на гликозидные соединения и, кроме сахарозы, гидролизует рафинозу, генцианозу и стахиозу; катализирует также фруктотрансферазные реакции. Инвертаза широко распространена в природе, она имеется у многих микроорганизмов, встречается почти во всех типах почв.

Определение активности инвертазы основано на учете восстанавливающих сахаров, образующихся при расщеплении сахарозы. Этот метод может быть использован для определения инвертазы в образцах почвы с широким диапазоном активности фермента и концентрации субстрата.

Ход работы

В колбу емкостью 50 мл помещают 5 г почвы, добавляют 10 мл 5 %-ного раствора сахарозы, 10 мл ацетатного буфера (рН 4,7) и 5–6 капель толуола. Колбы закрывают пробками, встряхивают и помещают в термостат при температуре 30 °C на 24 ч, периодически встряхивая их. Контроль — стерилизованная почва (3 ч при 180 °С) и чистый субстрат.

После инкубации содержимое колб фильтруют в 100-миллиметровые мерные колбы. В 10-20 мл фильтрата определяют восстанавливающие сахара по методу Бертрана. Для этого 10 мл фильтрата переносят в колбу, емкостью 100 мл и приливают 20 мл раствора Фелинга. Содержимое колбы кипятят 3 мин. Затем раствор фильтруют в колбу Бунзена через стеклянный фильтр №4, используя водоструйный насос. Осадок закиси меди в колбе и на фильтре промывают горячей свежепрокипяченой водой несколько раз до исчезновения щелочной реакции на лакмус. Затем переносят фильтр на чистую колбу Бунзена и осадок закиси меди растворяют, приливая 5-10 мл железоаммиачных квасцов. Колбу и фильтр промывают несколько раз дистиллированной водой до исчезновения кислой реакции на лакмус. Фильтрат в колбе Бунзена немедленно титруют 0,1 н раствором перманганата калия до устойчивой слабо-розовой окраски раствора.

На основании количества пошедшего на титрование раствора перманганата калия в миллилитрах вычисляют соответствующее ему количество меди в миллиграммах из расчета: 1 мл 0,1 н KMnO₄ эквивалентен 6,36 мг меди. Затем по таблице находят соответствующее количество глюкозы (в мг). После внесения поправки на контроль рассчитывают активность инвертазы.

Активность инвертазы выражают в миллиграммах глюкозы на 1 г почвы за 24 ч. Ошибка определения – до 5%.