Материалы и оборудование

Для постановки опыта: эрленмейеровские колбы объемом 75 или 100 мл, основная питательная среда без фосфора и калия, 10%-ные растворы и споры гриба Aspergillus niger, препаровальные иглы, бумажные этикетки.

Для результатов опыта: ванночки, большие часовые стекла, стеклянные крючки, колбы с водой, газетная и фильтровальная бумага, технические весы.

РАБОТА 8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ ВОДНЫХ ЭКСТРАКТОВ ПОЧВЫ И ИНДИВИДУАЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТА БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS PUTIDA

Цель - ознакомить с существующими методами исследования токсичности почвы, загрязненной различными водорастворимыми поллютантами. Методика основана на измерении ингибиторного эффекта образцов на рост клеток микроорганизмов.

При определении токсичности устанавливают:

1) среднюю летальную концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления пробы), вызывающую 50% ингибирование роста микроорганизмов за 16 часовую экспозицию;

2) безвредную концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления пробы), вызывающую 10% ингибирование роста микроорганизмов за 16-часовую экспозицию.

Характеристика тест-объекта

Pseudomonas putida - грам-отрицательная аэробная бактерия. Подвижные палочки диаметром 0,7-1,1 мкм, длиной 2,0-4,0 мкм с полярным типом жгутикования. Обычно встречается в почве и поверхностных водах. Температурный оптимум - 25-30⁰С.

Хранение и поддержание основной культуры

Основную культуру Pseudomonas putida хранят в пробирках на скошенном агаре (плотная питательная среда). Пересев культуры осуществляют 1 раз в неделю. Культуру инкубируют 24 часа при температуре 25⁰С±4⁰С. Через 24 часа инкубации может появляться зеленый пигмент.

Приготовление предварительной культуры

К 900 мл стерильной воды добавить по 25 мл растворов 1 и 3 и 50мл раствора 4. Разлить стерильно эту среду для предварительной культуры по 90 мл в колбы на 250 мл. Для приготовления предварительной культуры необходимо использовать основную культуру, выросшую на плотной среде возраст которой не более 7 суток. Смыть культуру со скошенного агара стерильной средой для предварительной культуры. Довести оптическую плотность предварительной культуры до 0,02 единиц оптической плотности (кювета 10 мм, λ=600 нм). Инкубировать предварительную культуру в течение 5 часов при перемешивании при температуре 25⁰С±4⁰С.

Ход работы

В стерильные колбы объемом 250 мл налить последовательно 80 мл исследуемого образца, по 2,5 мл растворов 2 и 3, 5,0 мл раствора 4. В качестве контроля вместо исследуемого образца добавить 80 мл стерильной воды. Затем добавить 10 мл предварительной культуры. Оптическая плотность инокулята должна составлять примерно 0,1 опт. ед. (кювета 10 мм, λ=600 нм), для того чтобы начальная плотность при биотестировании составляла 0,01 опт. ед. Измерить реальную начальную оптическую плотность в контрольном варианте. Повторность опыта и контроля – трехкратная.

Инкубировать контрольные и опытные варианты при температуре 23⁰С±1⁰С в темноте при перемешивании в течение 16 часов.

По истечении периода инкубации измерить конечную оптическую плотность культуры.

Оценка и обработка результатов

Процент ингибирования роста клеток рассчитывают по формуле:

I = (Вс-Вn) *100 / (Bc-B0), где

I - ингибирование роста клеток микроорганизмов, выраженное в

процентах;

Вn - конечная оптическая плотность микроорганизмов после 16-

часовой инкубации в опытном образце;

Вс - конечная оптическая плотность микроорганизмов после 16-

часовой инкубации в контрольном образце;

Во - начальная оптическая плотность микроорганизмов в контрольном

образце;

Если экспериментально не удалось получить точного значения кратности разбавления, вызывающего 50%-ное ингибирование роста культуры микроорганизмов, то для получения точного значения ЛКр₅₀ без выполнения дополнительных экспериментов используется графический метод.

Графический метод определения ЛКр₅₀

Чтобы получить на графике линейную зависимость, используют пробит анализ. Результаты выполненных экспериментов по установлению токсического действия заносятся в табл. 1.

Значения пробитов, соответствующие установленной кратности разведения, вызывающей снижение оптической плотности образцов. Находят по табл. 2. Процентные концентрации исследуемых образов переводят в десятичные логарифмы. По значениям пробитов и десятичных логарифмов от экспериментально полученных данных строят график.

Таблица 1

Концентрация экстракта и показатели токсичности (пример)

По оси абсцисс откладывают значения логарифмов процентных концентраций исследуемых образцов, по оси ординат – пробиты значений процента изменения оптической плотности образцов. Экспериментально полученные значения вносят в систему координат и через точки проводят прямую. Пробитное значение 5 соответствует 50%-ному ингибированию роста микроорганизмов (табл. 2).

Таблица 2

Значения пробитов, соответсвующих экспериментально устанавливаемой токсичности

Из точки пересечения координаты пробитного значения 5 и проведенной прямой опускают перпендикуляр на ось абсцисс, точка пересечения является логарифмом концентрации исследуемой пробы, вызвавшей 50%-ное ингибирование роста микроорганизмов за 16 часов экспозиции. Затем найденный логарифм концентрации исследуемого образца переводят в процентную концентрацию.

Таким образом, устанавливают среднюю летальную концентрацию разбавления исследуемого образца, вызывающего 50%-ное ингибирование роста тест-объектов за временную экспозицию