Проектирование типичного асептического аэробного микробиологического процесса и его ведение

Большинство промышленных микробиологических процессов имеют те или иные общие черты, однако на практике появляются существенно различающиеся проекты процессов и способы их ведения, что часто обусловлено разными требованиями к заражению системы вредными организмами. Если заражение вообще нежелательно, то процесс необходимо вести в асептических условиях при поддержании чистоты культуры. В некоторых случаях, например при росте дрожжей в слабокислой среде или при ферментации углеводородов тщательно подобранными штаммами бактерий, требования к соблюдению асептических условий могут быть несколько снижены, так как условия процесса сами по себе не стимулируют рост многих потенциально вредных микроорганизмов.

В этом разделе основное внимание будет уделено способам поддержания асептического режима, поскольку именно здесь очень многое зависит от умения и искусства биохимика-технолога. В нашем обсуждении мы будем придерживаться последовательности операций, принятой в периодическом процессе, и начнем с получения посевного материала (инокулята) из чистой культуры.

Подготовка посевного материала сводится к пролиферации небольшого числа клеток в строго контролируемых условиях до плотной суспензии, объем которой составляет 1—20% объема промышленного ферментера. Эта операция выполняется ступенчато путем постепенного увеличения масштаба. Исходным материалом служит чистая культура — тщательно поддерживаемая популяция данного штамма микроорганизма. Обычно нужный штамм получают в результате многочисленных экспериментов, включающих выведение множества мутантов, их скрининг и селекцию. Поскольку полученный таким путем штамм микроорганизмов может обладать целым рядом преимуществ, то при хранении необходимо обеспечить неизменность его генетической природы. Обычно генетическая стабильность штамма микроорганизмов достигается за счет максимального снижения его метаболической активности при хранении. Микроорганизмы, как правило, хранят в состоянии покоя в частично обезвоженном виде; обезвоживание осуществляют путем лиофилизации (сублимационной сушки) суспензии клеток в жидкости или путем тщательного высушивания дисперсии спор или клеток в стерильной почве или песке. Склонные к мутациям организмы часто подвержены обратным мутациям или иным нежелательным генетическим изменениям. В таких случаях важно регулярно контролировать чистоту культуры.

Если мы в качестве примера возьмем лиофилизованную культуру, то следующей стадией процесса получения посевного материала будет приготовление суспензии клеток в стерильной жидкости. Затем каплю этой суспензии переносят на скошенный агар, который приготавливают желатинизацией стерильной питательной среды в наклоненной пробирке с помощью агара — полисахарида, выделяемого из водорослей. После инкубации, обеспечивающей достаточный рост, клетки опять суспендируют в жидкости и наносят на агаровую поверхность большей площади в плоских сосудах Блэйка или Ру или переносят во встряхиваемый сосуд. Эти сосуды затем устанавливают на качалках, обеспечивающих перемешивание за счет вращательного или вращательно-поступательного движения; таким путем достигается рост погруженной культуры, а также адекватное поступление кислорода в культуру и выведение газов из нее. Обычно эту операцию повторяют несколько раз с сосудами все больших объемов и только затем переходят к следующей стадии. Все описанные операции переноса культуры должны выполняться в строго стерильных условиях. Для осуществления этих тонких операций на предприятиях микробиологической промышленности обычно предусматривают специальные помещения со стерильной атмосферой, асептическими условиями и регулированием температуры.

Дальнейшая пролиферация культуры осуществляется в одном или нескольких сосудах для посевного материала — небольших ферментерах, снабженных почти всеми контрольно-измерительными приборами, которые применяются в крупномасштабных процессах. В этих реакторах подбираются такие условия, которые бы обеспечивали максимальную скорость роста культуры.

На этой стадии получения посевного материала мы переходим от лабораторных экспериментов к заводским установкам и условиям. Здесь уместно ознакомиться с некоторыми основными принципами и методами поддержания асептического режима, а также с устройствами и операциями, применяющимися для достижения этой цели. Прежде всего, система должна иметь такое устройство, чтобы можно было проводить независимую стерилизацию всех входящих в ее состав узлов и компонентов. В качестве примера чрезвычайных мер предосторожности, которые должны предусматриваться в проекте системы и соблюдаться в процессе ее эксплуатации, рассмотрим частную проблему переноса инокулята из сосуда для посевного материала в промышленный реактор. На представленной на рис. 35 схеме изображены основные узлы и устройства, а также последовательность операций. Все клапаны системы должны быть доступны для проверки, чистки и стерилизации; по этой причине здесь наиболее популярны шаровые клапаны. Рис. 35 дает представление и о некоторых других общих принципах асептического процесса. Особое внимание должно быть обращено на паронепроницаемость всех соединений системы; в системе должны быть полностью исключены любые контакты между стерильными и нестерильными зонами. Поддержание в системе небольшого избыточного давления способствует тому, что все случайные утечки будут происходить только из системы, а не в обратном направлении.

РИС. 35. Система трубопроводов и запорно-регулирующей арматуры, используемая для асептической инокуляции крупномасштабного ферментера. Последовательность операций: 1) установить участок трубопровода AB; 2) стерилизовать этот участок паром при давлении 1,055 кг/см² в течение 20 мин; клапаны D и J открыты, клапан C закрыт, а конденсат собирается в ловушках, расположенных в узлах H и I; 3) клапаны C, G, H, I, J закрыть; клапаны D, Е, F открыть; охладить ферментер под давлением стерильного воздуха, при этом стерильная среда заполняет соединительный трубопровод; 4) в резервуаре для посевного материала повысить давление до 0,7 кг/см², а в ферментере снизить до 0,14 кг/см²; 5) перевести инокулят в ферментер, открыв клапан C; 6) отключить резервуар для посевного материала и ферментер от системы подачи пара, закрыв вентили F и С; открыть вентили G и J, спустить пар и конденсат, частично открыв вентили D и E.

На рис. 36 приведен чертеж общего вида (с указанием основных узлов и размеров) промышленного ферментера, выпускаемого в серийном масштабе. Обычно такие ферментеры изготавливают из нержавеющей стали, что существенно снижает возможность коррозии аппаратуры и сводит к минимуму опасность загрязнения культуральной жидкости нежелательными ионами металлов. Как в самом ферментере, так и в любых других аппаратах и элементах системы не должно быть застойных зон, щелей, трещин и других участков, в которых могут накапливаться устойчивые к стерилизации твердые вещества и в которых растущие микроорганизмы могут образовывать плотные скопления и пленки. Решить эти проблемы помогает применение цельносварных конструкций с тщательно зачищенными и отполированными сварными швами.

Перемешивающее устройство должно обеспечивать перемешивание и аэрацию системы в той степени, в какой это необходимо. Чтобы исключить возможность заражения культуры, при проектировании и в процессе эксплуатации реакторов особое внимание следует уделять асептическим уплотнениям. В лабораторных ферментерах обычно достаточно одной лопастной мешалки, а в больших промышленных реакторах могут потребоваться несколько перемешивающих устройств.

Обычно только 70—80% объема реактора занимает жидкая фаза, а верхнюю его часть заполняют газы. Часто перемешивание и аэрация жидкости способствуют образованию пены на ее поверхности, особенно если в среде в больших концентрациях содержатся пептиды.

РИС. 36, а. Ферментер объемом 100 000 л для получения пенициллина. [Из работы; Аиба Ш., Хемфри А., Миллис Н., Биохимическая технология и аппаратура.— М.; Пищевая промышленность, 1975.]

РИС. 36, б. Большой промышленный ферментер; вид сверху. [Из статьи Мйііег R., Kieslich К., Technology of the Microbiological Preparation to Organic Substances; Angew. Chem., Intern. Edit., 5, 653 (1966).]

Пена препятствует газообмену между культуральной жидкостью и находящимся над ней пространством; она может выйти из ферментера и загрязнить систему, если составляющие пену пузырьки коалесцируют и образующаяся жидкая фаза вновь поступает в ферментер. В изображенном на рис. 36 ферментере для разрушения пены над уровнем жидкой фазы устанавливают дополнительную мешалку. В случае особенно устойчивых пен к культуральной жидкости добавляют особые вещества — пеногасители, дестабилизирующие пену путем снижения поверхностного натяжения.

Поверхностно-активные свойства пеногасителей могут явиться причиной снижения скорости переноса кислорода.

Змеевик теплообменника в реакторе может выполнять несколько функций. Если предполагается периодически стерилизовать среду в самом ферментере, то змеевик должен обеспечивать необходимые скорости нагревания и охлаждения. Теплообменное устройство должно также справляться с пиковыми нагрузками, куда входят тепловые эффекты микробиологического процесса, а также вязкое рассеяние теплоты, выделяющейся при перемешивании. Коэффициенты теплопередачи для не инокулированной среды примерно равны коэффициенту теплопередачи воды, в то время как плотная мицелиальная культура по этим характеристикам приближается к пастам.

Процесс в ферментере может продолжаться от суток (или даже менее) до 2 нед. и более; чаще всего процесс биосинтеза антибиотика длится от 4 до 5 сут. В течение этого времени необходимо поддерживать строгий режим процесса, а в ряде случаев те или иные параметры необходимо изменять в соответствии с определенной программой. Тем не менее, даже наш краткий обзор может дать представление о сложности и трудоемкости асептических процессов ферментации, а также о высокой стоимости этих работ. Очевидно, в такой ситуации потеря продуктов даже одного периодического процесса может быть связана с очень большими расходами, что оправдывает отмечавшееся выше большое внимание, уделяемое стерилизации.