Характеристика кумаринов.

Кумарины — природные соединения, производные бензо-альфа-пирона или производные циклизированной орто-оксикоричной кислоты. Кумарин представляет собой лактон ненасыщенной ароматической о-оксикоричной кислоты, называемой кумариновой кислотой. Одно из наиболее характерных свойств кумаринов каклактонов — специфическое отношение к действию щелочей. Кумарины не расщепляются при длительном нагревании в воде, устойчивы в холодных растворах щелочей, но гидролизуются при действии горячих разбавленных растворов гидроксида натрия или калия с образованием жёлтых растворов солей кумариновой кислоты (кумаринатов). Кумариновые кислоты присутствуют в растворе лишь в виде солей, в свободном состоянии не могут быть получены (за редким исключением), так как при подкислении щелочных растворов вновь образуются кумарины-лактоны в первоначальном состоянии. Это свойство кумаринов широко используют для их выделения из растений и очистки от примесей балластных веществ.

При длительном нагревании кумаринов в водных или спиртовых растворах щелочей происходит изомеризация образующегося первоначально кумарината. Из солей цис-о-оксикоричной кислоты образуются изомеры — кумараты (соли транс-о-оксикоричной, или кумаровой, кислоты). Процесс превращения сопровождается изменением окраски от жёлтой до коричневой. Кумариновая и кумаровая кислоты — геометрические изомеры.

На цис-транс-изомерию кумаринов в щелочной среде влияет ряд факторов: длительность опыта, температура, освещение, характер и положение заместителей, рН среды. При подкислении раствора, содержащего соли кумариновой кислоты, вновь образуются кумарины (процесс обратимый), а при образовании солей кумаровой кислоты при подкислении кумарины не образуются (процесс необратимый). Из подкисленного раствора кумарата легко выделяется свободная кумаровая кислота в кристаллическом состоянии, температура её плавления выше, чем у соответствующего кумарина. Производные кумарина содержатся во многих растениях, особенно семейств зонтичных, рутовых, бобовых, обнаружены также в продуктах жизнедеятельности микроорганизмов и животных. В растениях наиболее часто содержатся простые производные кумарина и фурокумарина в свободном состоянии, оксикумарины могут находиться в форме гликозидов. Оксикумарины содержатся в траве донника лекарственного семейства бобовых, семенах конского каштана семейства конскокаштановых, траве грыжника, плодах жгун-корня, траве скополии и др. Фурокумарины преимущественно находятся в растениях семейства зонтичных: плодах амми большой, корнях горичника, а также растениях семейства бобовых: корне и плодах псоралии. Кумарины локализуются в различных органах растений, больше всего — в корнях, коре, плодах, меньше — в стеблях и листьях. Содержание кумаринов в различных растениях колеблется от 0,2 до 10%, в смеси, как правило, содержится 5—10 различных кумаринов. Роль кумаринов в жизнедеятельности растений разнообразна и недостаточно выяснена. Одни из них — ингибиторы роста, другие стимулируют прорастание семян. Кумарины могут служить защитными веществами при некоторых заболеваниях растений.

49. Классификация кумаринов основана на особенностях их химического строения, связанных с наличием в их структуре функциональных групп и различных дополнительных гетероциклов или бензола. Наиболее часто кумарины подразделяют на следующие группы.

1. Простые кумарины: кумарин (а-бензопирон), изокумарин и 3,4- дигидрокумарин.

2. Окси- и метокеикумарины, содержащие в различных положениях окси- или метоксигруппы и имеющие специфические тривиальные названия. Часто оксикумарины содержатся в растениях в виде гликозидов.

Структурные формулы простых кумаринов.

Структурные формулы окси- и метоксикумаринов.

Структурные формулы гликозидов оксикумаринов.

3. Фурокумарины. Фурановый цикл может присоединяться к кумарину в различных положениях, часто в составе фурокумаринов находятся окси- и метиокси-группы.

4. Пиранокумарины (хромено-а-пироны). В их состав наряду с кумариновым входит пирановый гетероцикл.

К пиранокумаринам относят виснадин и дигидросамидин, обнаруженные в корневищах и корнях вздутоплодника сибирского.

5. Бензокумарины. В состав соединений этой группы входит дополнительно бензольный цикл.

6. Фуробензокумарины, содержащие в структуре дополнительно бициклическую систему, состоящую из фуранового и бензольного циклов, а также (возможно) окси- и метоксигруппы.

Структурные формулы фурокумаринов.

Структурные формулы пиранокумаринов.

При большом разнообразии кумаринов в растениях перечисленные выше группы — основные. Кумариновая группировка входит также и в структуру БАВ сложного состава, например, некоторых антибиотиков (новобиоцина, афлатоксина и др.).

Кумарины представляют собой белые или желтоватые, бесцветные, душистые, кристаллические вещества. При нагревании до 100 "С и выше кумарины легко возгоняются. Ими предположительно обусловлен специфический запах сена. Многие кумарины и фурокумарины проявляют характерную флюоресценцию в УФ-свете с возникновением зеленоватого, жёлтого, фиолетового и голубого (например, производные 7-оксикумарина) цветов. Количество, характер и положение заместителей в структуре кумаринов влияют на интенсивность флюоресценции. Кумарины растворимы в органических растворителях (хлороформе, дихлорэтане, спиртах), мало растворимы в петролейном эфире, плохо (практически нерастворимы) — в воде. Растворимость кумаринов в воде увеличивается, если они содержатся в виде гликозидов или при наличии оксигрупп. В зависимости от полярности некоторые кумарины можно разделить методом колоночной хроматографии на гидрофильных или гидрофобных сорбентах при сочетании с избирательным элюированием различными растворителями. В целом функциональные группы в структуре кумаринов определяют их растворимость, полярность и сродство к различным сорбентам.

Некоторые из кумаринов оказывают спазмолитическое, сосудорасширяющее, диуретическое или успокаивающее действия. Фурокумарины обладают сильными фотосенснбилизирующими свойствами (повышают чувствительность кожи к инсоляции), их применяют для лечения ряда кожных заболеваний (например, препараты бероксан, аммифурин, псорален). Ряд кумаринов обладает наркотическими, эстрогенными, аналгезирующим, бактериостатическим и другими свойствами. Производные пиранокумаринов оказывают спазмолитическое и коронарорасширяющее действия. Применяют спазмолитический препарат фловерин (из корней вздутоплодника сибирского). Фурокумарины (пейцеданин) усиливают действие алкилирующих противоопухолевых препаратов.

51. Методы выделения кумаринов. разделить на три группы: химические, экстракционные и хроматографические.

Химические методы (метод Шпета)Выделение смеси кумаринов и очистка их от балластных веществ основаны на специфическом свойстве: обратимом раскрытии лактонного кольца в щелочной среде при нагревании и закрытии — в кислой среде. При раскрытии кольца в щелочной среде образуются соли кумариновой кислоты, растворимые в воде, а в кислой среде — лактоны, растворимые в органических растворителях и не растворимые в воде. На основании избирательной растворимости кумарины отделяют от балластных веществ. Методика: измельчённое растительное сырьё обрабатывают эфиром. Сконцентрированный эфирный экстракт промывают 0,5% раствором гидроксида натрия для удаления фенольных соединений и органических кислот. Затем раствор смешивают с 5—10% спиртовым раствором гидроксида натрия и оставляют при нагревании на несколько часов. Происходят омыление сложных эфиров и раскрытие а-пироновых циклов кумаринов с образованием солей соответствующих кислот. Для удаления неомыляемых веществ (высокомолекулярных спиртов, стеринов и т.д.) жидкость обрабатывают эфиром, предварительно разбавив её 6—8-кратным количеством воды. Далее водно-щелочной раствор подкисляют, образовавшиеся при этом кумарины извлекают эфиром. Одновременно в эфир переходят фенолы и полученные после омыления кислоты. Эти балластные вещества удаляют промывкой эфирного извлечения 0,5% раствором гидроксида натрия. При сгущении эфирного раствора получают техническую смесь кумаринов в виде смолистого осадка или кристаллов. Недостатки метода — возможность необратимых изменений многих кумаринов при нагревании, невозможность применения для выделения ацилированных фуро- и пиранокумаринов (образуются оксилактоны). Для разделения кумаринов используют вакуум-перегонку, вакуум- сублимацию и дробную перекристаллизацию.

Экстракционные методы.Для экстрагирования сырья используют неполярные растворители (гексан, петролейный эфир, сжиженные газы). Затем вытяжки сгущают, кумарины, обладающие низкой растворимостью, выпадают осадок. Метод эффективен для выделения ацилированных фуро- и пиранокумаринов. Применение сжиженных газов (фреона-12, угольной кислоты) позволяет быстро в нативном состоянии с высоким выходом выделить смесь кумаринов. Разделение и очистку кумаринов осуществляют избирательной экстракцией органическими растворителями (четырёххлористым углеродом, петролейным эфиром, гексаном и др.), упаркой, обработкой извлечений углем и дробной кристаллизацией. Недостатки метода — использование большого количество огне- и взрывоопасных веществ, а также длительность процессов.

Хроматографодческие методы Растительное сырьё экстрагируют последовательно растворителями с возрастающей полярностью (петролейным эфиром, этиловым эфиром, бензолом, хлороформом и этилацетатом) или спиртом. Затем извлечения концентрируют и остатки наносят на хроматографические колонки с оксидом алюминия (реже с другими сорбентами). Осуществляют элюирование сначала петролейным эфиром, затем растворителями с возрастающей полярностью. Элюаты упаривают, проводят кристаллизацию кумаринов, далее их перекристаллизовывают (дробная кристаллизация), чаще из этилового спирта. Процессы выделения и разделения характеризуются длительностью и сопровождаются большими потерями кумаринов. В качестве примера производства суммарных очищенных препаратов, содержащих кумарины, далее рассмотрена технология аммифурина.

52. Производство аммифурина.Аммифурин — суммарный очищенный новогаленовый препарат, содержащий сумму фурокумаринов (изопимпинеллин, бергаптен и ксантотоксин), выделенную из плодов амми большой. Структурные формулы фурокумаринов

Содержание суммы фурокумаринов в препарате в пересчёте на сухое вещество должно быть не ниже 95%. Аммифурин представляет собой кристаллический порошок светло-жёлтого цвета со специфическим запахом, хорошо растворим в горячих этиловом и метиловом спиртах, мало растворим в холодных органических растворителях, не растворим в воде. Препарат обладает фотосенсибилизирующей активностью, тонизирует гладкие мышцы кишечника и матки. ТП состоит из следующих стадий. Семена измельчают до размера частиц 0,5—1 мм. Степень измельчённости оказывает большое влияние на выход фурокумаринов в процессе экстракции. В качестве экстрагента используют этиловый спирт-ректификат. Экстракцию ведут в реакторе с обратным холодильником кипящим спиртом (соотношение спирта к сырью равно 1:6). Экстракция продолжается 2 ч. Извлечение передавливают сжатым азотом. Экстрагируют сырьё 3 раза. Два первых извлечения передают на обработку, а третье используют для первичной экстракции новой порции сырья, Вакуум-выпаривание и осаждение суммы фурокумаринов. Объединённые первое и второе извлечения упаривают в вакууме до кубового остатка приблизительно 1/6 первоначального объёма, затем кумарины осаждают при энергичном перемешивании с 2-кратным количеством воды. Смесь охлаждают до 2-4 °С. В течение суток выпадает смесь фурокумаринов со смолами, осадок отфильтровывают на нутч-фильтре и промывают водой. Получают сумму фурокумаринов в виде смолки зелёного цвета.

Получение технического аммифурина. Сумму фурокумаринов заливают полуторным количеством горячей (80—82 °С) воды, перемешивают и получают кашицеобразную массу. К массе добавляют половинное (по отношению к фурокумаринам) количество гидроксида кальция и разбавляют равным по отношению к смеси объёмом горячей (80—85 °С) воды. Всё перемешивают 10—15 мин и оставляют на 1 ч. Фурокумарины переходят в водный раствор, а смолы и балластные вещества остаются в виде осадка. Вследствие расщепления лактонного цикла образуется кальциевая соль кумариновой кислоты. Кальциевая соль ароматической оксикислоты растворима в воде, раствор отфильтровывают от осадка балластных веществ на нутч-фильтре. Осадок выбрасывают. Перевод соли в кумарины. Фильтрат в реакторе подкисляют хлороводородной кислотой до рН = 2 при перемешивании. Происходит образование a-пиронового (лактонного) кольца. Экстракция жидкость-жидкость. Из водного раствора фурокумарины экстрагируют хлороформом семь раз. Для первой экстракции берут 2 части хлороформа на 10 частей водной фазы (1:5), остальные экстракции проводят при соотношении 1:10 при перемешивании в течение 5-10 мин. Выпарка. Объединённые хлороформные вытяжки упаривают до 1/8 первоначального объёма, затем до густоватой массы. Перекристаллизация. Густую массу заливают двумя объёмами этилового спирта и нагревают до кипения, горячий раствор фильтруют через обогреваемый фильтр, далее раствор помещают в холодильник на 6-8 ч при 4 °С для кристаллизации аммифурина. Кристаллы отфильтровывают и сушат в вакуум-сушилке. Получают технический аммифурин. Получение фармакопейного продукта (перекристаллизация). Полученный кристаллический порошок заливают 10-кратным количеством спирта-ректификата и нагревают на водяной бане до кипения, раствор фильтруют через обогреваемый фильтр. Затем раствор охлаждают в холодильнике в течение 6—8 ч при 4 °С, Полученный осадок отфильтровывают, промывают охлаждённым спиртом, сушат в вакуум-сушилке. Получают фармакопейный аммифурин. Выход препарата составляет 50,2%, выход по кумаринам — приблизительно 36%.

53. Анализ кумаринов. Количественное определение суммы кумаринов (гравиметрический метод) по методике, разработанной Г.К. Никоновым. Навеску из 25 г измельчённого сырья экстрагируют в установке типа «Сокслет» хлороформом в течение 5 ч. Из хлороформного извлечения отгоняют растворитель. Остаток заливают 50 мл 10% водного раствора гидроксида калия и нагревают на водяной бане (70-80 °С) в течение 5 мин. Затем водный раствор обрабатывают в делительной воронке хлороформом порциями по 25 мл 4—5-кратно, освобождают кумарины от балластных веществ (стеринов, спиртов, литшдов, углеводородов). Балластные вещества переходят в хлороформ, а кумарины в виде калиевой соли кумариновой кислоты остаются в воде. Далее водный щелочной раствор подкисляют 20% водным раствором серной кислоты и извлекают кумарины хлороформом порциями по 25 мл 5— 6 раз (проба на сухой остаток). Кумарины в виде лактонов переходят в хлороформное извлечение вместе с органическими кислотами. Для удаления органических кислот и фенолов хлороформное извлечение сначала обрабатывают 25 мл 5% раствора карбоната натрия, а далее водой. Хлороформный раствор кумаринов обезвоживают прокалённым сульфатом натрия, который отфильтровывают, а хлороформное извлечение заливают в предварительно взвешенную колбу. Хлороформ отгоняют, остаток высушивают при 70 "С до постоянной массы. Затем определяют содержание кумаринов в процентах от загруженного сырья. В препаратах кумарины определяют фотоколориметрическими методами по образованию вишнёво-красной окраски в щелочной среде с диазотированными соединениями. Возможно также использование спектрометрии, флюоресциметрии в УФ-области, предложены полярографические методы, хроматоспектрофотометрический и хроматополярографический методы.