ОЧИСТКА ВЫТЯЖЕК ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ОТ ПРИМЕСЕЙ

Вытяжки, полученные настаиванием биологического материала с подкисленной водой или с подкисленным этиловым спиртом, всегда содержат определенное количество примесей белковых веществ, аминокислот, липидов и других соединений, мешающих обнаружению и количественному определению ядовитых веществ, находящихся в этих вытяжках. В связи с этим вытяжки из биологического материала подвергают очистке от примесей.

Известно несколько способов очистки вытяжек. Для этой цели применяется фильтрование, центрифугирование, осаждение, экстракция и ряд физико-химических методов.

Фильтрование и центрифугирование. Для очистки вытяжек от механических загрязнений (мелких частичек биологического материала) применяют фильтрование. Однако через поры фильтров могут проходить более мелкие частицы твердых веществ, размер которых меньше диаметра пор фильтров. Кроме этого, материалом фильтров могут адсорбироваться определенные количества ядовитых веществ, которые выделяют из биологического материала. Учитывая указанные выше недостатки фильтрования, как метода очистки вытяжек от примесей, для этой цели применяют метод центрифугирования.

Осаждение ггримесей. Примеси, переходящие из биологического материала в вытяжки, которые проходят через поры фильтров и не осаждаются при центрифугировании, могут осаждаться соответствующими реактивами. Ряд реактивов применяют не только для очистки вытяжек из биологического материала, но и для осаждения белковых и других веществ из крови. К числу таких реактивов относятся: трихлоруксусная, вольфрамовая, ме-тафосфорная кислоты; некоторые гетерополикислоты (фосфорно-вольфрамовая, фосфорно-молибденовая) и другие вещества. Причем фосфорно-вольфрамовая и фосфорно-молибденовая кислоты осаждают белки и пептиды, а трихлоруксусная кислота осаждает белки, но не осаждает пептиды.

Ряд белковых веществ осаждается под влиянием температуры. При повышении температуры приблизительно до 40 °С растворимость большинства белков возрастает (из этого правила имеются исключения). При дальнейшем повышении температуры происходит денатурация белковых веществ, понижается их растворимость, в результате чего они выпадают в осадок. Такой способ очистки вытяжек применяется при выделении алкалоидов из биологического материала по методу Стаса — Отто.

Как отмечалось выше, от прибавления этилового и метилового спиртов, ацетона и других органических растворителей, смешивающихся с водой, понижается растворимость белковых веществ. В результате этого они могут выпадать в осадок.

Одним из эффективных методов освобождения вытяжек из биологического материала от белковых веществ и других примесей является высаливание. Эффективность высаливания зависит от концентрации и природы электролитов, прибавляемых к растворам или вытяжкам из биологического материала.

При низких концентрациях нейтральные электролиты повышают растворимость многих белковых веществ. Этот эффект не зависит от природы применяемой соли, но зависит от ее концентрации и заряда ионов, входящих в состав соли. Соли, содержащие двухвалентные ионы, повышают растворимость белков лучше, чем соли, состоящие из одновалентных ионов. Повышение растворимости белковых веществ под влиянием низких концентраций электролитов объясняется изменением степени диссоциации ионизированных (карбоксильных, фенольных, сульфгидрильных) групп белков.

С повышением концентрации солей, прибавляемых к вытяжкам, растворимость белков понижается, а при дальнейшем прибавлении этих солей белковые вещества могут выпадать в осадок.

По данным литературы, высаливание является одним из эффективных методов осаждения примесей из вытяжек, полученных при настаивании гнилостного биологического материала с подкисленной водой.

Высаливание используется не только для повышения или понижения растворимости белковых веществ. В химико-токсикологическом анализе высаливание может применяться и для повышения степени экстракции многих ядовитых веществ из водных растворов (см. гл. III, § 1).

Осаждение белковых веществ из вытяжек можно производить путем изменения рН среды. При рН, соответствующем изоэлектрической точке белка, он не несет суммарного заряда. Поэтому при указанном рН между соседними молекулами белка отсутствует электростатическое отталкивание. В результате этого происходит слипание молекул белка и выпадение его в осадок. При значениях рН выше или ниже изоэлектрической точки белка его молекулы имеют суммарный заряд одного знака, и поэтому выпадение белка в осадок не происходит.

Все перечисленные выше методы осаждения примесей до некоторой степени позволяют освободить вытяжки из биологического материала от белковых и других веществ. С помощью метода, основанного на осаждении примесей соответствующими реактивами (фосфорно-вольфрамовой, фосфорно-молибденовой кислотами и др.), можно очистить вытяжки не только от белковых веществ, но и от некоторых других азотсодержащих соединений. Однако некоторые примеси из вытяжек невозможно осадить с помощью перечисленных выше методов.

Необходимо отметить, что методы очистки вытяжек, основанные на осаждении примесей, имеют и некоторые недостатки. Осадки примесей могут адсорбировать на своей поверхности отдельные, подлежащие исследованию, токсические вещества. Адсорбция токсических веществ осадками примесей может быть одной из причин потерь исследуемых веществ в ходе химико-токсикологического анализа.

Экстракция примесей из вытяжек. В химико-токсикологическом анализе для очистки вытяжек из биологического материала метод экстракции применяется более часто, чем другие методы. При помощи метода экстракции можно очистить вытяжки от липидов, аминокислот, продуктов их декарбоксилирования и дезаминирования, а также от ряда других примесей. Экстракция примесей из вытяжек успешно проходит только тогда, когда правильно выбран несмешивающийся с водой органический растворитель и установлено соответствующее значение рН среды, из которой извлекают примеси. При неправильно выбранном рН среды совместно с примесями может экстрагироваться и определенное количество исследуемого вещества. Экстракция примесей должна производиться при таком значении рН среды, при котором не экстрагируются исследуемые вещества, находящиеся в вытяжках.

Применение физико-химических методов для очистки вытяжек. В последнее время в химико-токсикологическом анализе для очистки вытяжек из биологического материала от примесей внедряются некоторые физико-химические методы. Для этой цели применяются методы ионообменной хроматографии, гель-хроматографии, молекулярной адсорбционной хроматографии на колонках и др. Методы хроматографии на бумаге, в тонких слоях сорбентов, а также методы электрофореза в основном используются для обнаружения токсических веществ, находящихся в вытяжках из биологического материала. В ряде случаев эти методы пригодны для обнаружения исследуемых веществ в вытяжках без предварительной очистки их от примесей.