Моноклональные антитела

Для многих исследований, связанных с изучением биологических структур (гормоны, макромолекулы, биорегуляторы) большую ценность представляют реагенты, способные специфически взаимодействовать с данной структурой. Универсальным реагентом, обладающим указанным свойством, считается молекула иммуноглобулина. Несмотря на то, что иммуноглобулины, являясь антителами, взаимодействуют только с антигеном, т. е. с молекулой, способной вызвать иммунный ответ, для большинства структур удаётся подобрать условия, при которых они становятся антигенами и индуцируют выработку комплементарных антител (например, при конъюгации с сильными иммуногенами). Именно этим объясняется большое распространение иммунологических методов, связанных с использованием антител.

Иммунная система вырабатывает специфические антитела на огромное множество антигенов. В основе такой способности лежит наличие большого разнообразия клонов лимфоцитов, каждый из которых вырабатывает антитела одного типа с узкой специфичностью.

Общее число клонов у мышей равно 10⁷-10¹⁰. В ответ на данный антиген в реакцию вовлекается множество клонов, что обусловливает высокую гетерогенность получаемых антител. Так, при иммунизации комплексом гаптен – белок образуется до 8000 различных антител. Спектр вырабатываемых антител изменяется в ходе иммунного ответа, а также при использовании различных животных.

В 1975 г. Д. Кёлер и Ц. Милстейн предложили принципиально новый метод получения гомогенных антител. Они осуществили слияние клетки опухоли (плазмацитомы) с клетками селезёнки иммунизированного животного получив, таким образом, гибридные клетки (гибридомы), унаследовавшие от опухолевых клеток способность неограниченно размножаться, а от клеток селезёнки – синтезировать антитела предопределённой специфичности.

Эта работа возвестила о наступлении нового этапа в использовании антител в различных областях биологии и медицины. Метод очень быстро получил широкое распространение во всём мире, и уже в 1978 году собралась представительная конференция, на которой рассматривались вопросы техники получения и области использования моноклональных антител. Вклад Д. Кёлера и Ц. Милстейна в развитии науки был по достоинству оценён мировой общественностью, и в 1984 г. им была присуждена Нобелевская премия.

Предпосылками для возникновения метода получения гибридом, синтезирующих моноклональные антитела, были разработки двух методических подходов:

1. Получение миелом, адаптация их к условиям культивирования вне организма;

2. Метод соматической гибридизации клеток.

Первая предпосылка. У мышей можно легко получить миеломы (плазмацитомы). Эти опухоли являются потомками одной клетки (т. е. имеют моноклональное происхождение) и секретируют уникальные иммуноглобулины, некоторые из которых могут взаимодействовать с известными антигенами. Опухоли создают у них путём внутрибрюшного введения минеральных масел или инертного твёрдого пластика.

Убедившись в том, что в гибридах миеломных клеток синтезируются иммуноглобулины родительских линий, Д.Кёлер и Ц.Милстейн провели слияние миеломных клеток с нормальными клетками селезёнки мышей, иммунизированных эритроцитами барана. Такие гибриды длительно росли в культуре. Следовательно, удалось «обессмертить» продуцентов определённых антител, в данном случае антител против эритроцитов барана.

В этих экспериментах и была использована система ГАТ (система ГАТ, содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин), когда только одна родительская линия, а именно миелома Р₃/Х₆₃–Аg^-8, была химически маркирована. Селекция гибридов основана на том, что в ГАТ среде родительские миеломные клетки погибают. Нормальные клетки селезёнки не обладают способностью к расту при данных условиях культивирования, поэтому выживают и размножаются только гибридные клетки, унаследовавшие от родительских клеток способность размножаться и синтезировать специфические иммуноглобулины.

Этапы получения моноклональных антител включают в себя:

1. Иммунизацию животных.

2. Подготовку миеломных клеток к слиянию.

3. Слияние.

4. Клонирование гибридомных клеток.

5. Выявление антител, синтезируемых гибридомными клетками.

6. Активное наращивание (культивирование) гибридомных клеток, синтезирующих моноклональные антитела.

Обычно вся процедура от момента начала иммунизации до выделения антител занимает 3-4 мес. (рис. 7.11).

Рис. 7.11. Этапы получения моноклональных антител

1. Иммунизация животных.

Обычно для иммунизации используют мышей и крыс. Это связано с тем, что их подходящие миеломные клетки широко распространены и, кроме того, не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих животных. При иммунизации мышей берут линию Bald / С. Это оптимально в связи с тем, что все имеющиеся миеломные линии, образующие гибридомы, получены от этих мышей.

Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности, и перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны сливаться и образовывать антителообразующие гибридные клетки. Для гибридизации необходимо выделять селезёночные клетки животных через 3-4 суток после последнего введения антигена, т. е. тогда, когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих клеток.

Антигены клеточной поверхности являются сильными иммуногенами, тогда как большинство растворимых белков – слабые иммуногены. В этом случае применяют различные адъюванты, усиливающие иммунный ответ. Среди адъювантов наибольшее распространение получил ПАФ (адъювант Фрейнда). В ходе иммунизации необходимо определять титр антител к антигену (титр антител – величина, обратная разведению сыворотки, при которой степень иммунологической реакции снижается в два раза по сравнению с максимальной). Обычно это делают перед последней иммунизацией. В опыт отбирают животных с высоким титром антител. Не будет хороших результатов гибридизации, если при иммунизации у животных нет образования антител.

Используется следующая схема иммунизации:

1. Вводят 1-100 мкг антигена в составе ПАФ внутрибрюшинно.

2. Через 2-3 недели вводят антиген на физиологическом растворе внутрибрюшинно.

3. Последнюю иммунизацию делают внутривенно. Через 3 суток животных забивают и готовят суспензию для гибридизации.

2.Подготовка миеломных клеток к слиянию.

Подготовка миеломных клеток, является важным фактором для получения гибридом. При их культивировании необходимо руководствоваться следующими требованиями:

Как только в распоряжение исследователя поступили линии мышиных клеток с хорошей способностью образовывать гибридомы, необходимо размножить их и заморозить достаточное число ампул.

Следует использовать клетки в течение не более одного месяца после разморозки, так как у них постепенно падает способность образовывать гибридомы.

Клетки для слияния берут при логарифмической фазе роста. До момента слияния клетки должны находиться в этой фазе не менее одной недели.

Целесообразно периодически культивировать клетки в присутствии токсического аналога нуклеотидов (8-азагуанин). Для приготовления 1000 – кратного раствора взвешивают 15 мг вещества и растворяют в 1 мл диметилсульфоксида.

Клетки обычно адаптируются к одному виду среды и плохо переносят её замену. Поэтому при получении клеток из другой лаборатории необходимо культивировать их в той же среде, которая использовалась в этой лаборатории. При отсутствии такой возможности клетки надо постепенно адаптировать к новой среде, для чего на промежуточном этапе используют смесь двух сред.

Ни в коем случае нельзя допускать дорастания культур до высокой плотности, при которой начинается массовая гибель клеток. Если превышена плотность 10⁶/мл, то лучше такую культуру выбраковать и разморозить новую партию клеток.

Подготовка клеток питающего состава. В качестве клеток питающего состава используют клетки селезёнки в комплексе с перитонеальными сингенными макрофагами. Обычно их получают от мышей без предварительного введения им стимулятора из-за опасений, что активированные макрофаги могут убивать гибридомные клетки. Клетки питательного состава, в форме смеси миеломных и селезёночных клеток, обработанных полиэтиленгликолем, добавляют для слияния.

3. Слияние.

Методика слияния предусматривает определённую последовательность проведения мероприятий.

При этом важно, чтобы вместо клеток питающего слоя была использована кондиционированная среда. Среду, кондиционированную перитонеальными макрофагами, добавляют к среде культивирования в соотношении 1:1.

Рекомендуется добавлять систему ГАТ сразу же после слияния, а культуры после слияния не трогать несколько дней (даже не открывать СО₂-инкубатор). Это объясняется тем, что клетки после слияния очень чувствительны к изменениям внешней температуры, проявляющимся в период извлечения планшетов из СО₂-инкубатора.

4. Клонирование гибридомных клеток.

Клонирование гибридомных клеток осуществляетсяв полужидком агаре. Под микроскопом извлекают, пользуясь пастеровской пипеткой, из агара колонии положительные клетки этих клонов и переносят в жидкую культуру для замораживания в жидком азоте.

5. Выявление антител синтезируемых гибридомными клетками.

Для выявления антител, синтезируемых гибридомными клетками, используют иммуноферментный метод.

В данном методе используют антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные ферментом, а о результате судят по появлению цветной реакции. Принцип метода представлен на рис. 7.12.

● Положительные клетки помещают в лунки96-ти луночного планшета для микротитрования, приливают культуральную жидкость, в которой могут быть антитела;

● После инкубации и отмывки в лунки заливают раствор субстрата;

● Если в культуральной жидкости имеются антитела против антигена, то они адсорбируются на антигене, а на них адсорбируются конъюгированные с ферментом вторичные антитела;

● Под действием фермента происходит разложение субстрата и переход его в окрашенный продукт.

Рис. 7.12. Схема проведения основных этапов