ФЕРМЕНТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В ПРОИЗВОДСТВЕ

В своей практической деятельности человек использует ферментативную активность микроорганизмов очень давно. Культуры грибов уже несколько тысяч лет назад в Китае, Корее, Японии и некоторых других странах применяли для осахаривания крахмалистых продуктов и для получения спирта.

Винокурение, хлебопечение, обработка волокнистых растений, получение кисломолочных продувов известны человечеству с давних времен. Однако использование не ферментной активности микроорганизмов, а собственно ферментов как индивидуальных химических соединений специфического и сложного строения началось сравнительно недавно. Ферменты в промышленных масштабах производятся в ССС, Японии, США, Англии, Франции, Голландии, Дании, Швейцарии, Чехословакии, Венгрии, Польше и ряде других стран.

Основными поставщиками ферментов из микроорганизмов до последнего времени были грибы. Однако сейчас все более широкое применение находят ферменты и некоторых бактерий (табл. 18.1).

Согласно принятой системе классификации все ферменты подразделяют на шесть классов. 1. Оксидоредуктазы. 2. Трансферазы. 3. Гидролазы. 4. Лиазы. 5. Изомеразы. 6. Лигазы (синтетазы).

Наиболее широкое применение получили ферменты микроорганизмов, относящиеся в гидролазам (гликозидазы, пептидазы и др.). Они воздействуют на глюкозидные, пептидные, эфирные и некоторые другие связи с участием воды:

XY+HOH→XH+YOH

Среди гидролаз много внеклеточных ферментов. Выделяясь из клеток, они накапливаются в культуральной среде. Получение таких ферментов, как уже отмечалось, проще и дешевле, чем выделение из клеток. Поэтому гидролазы представляют особый интерес и наиболее часто используются.

Гликозидазы

К гликозидазам относится большое число микробных ферментов, катализирующих гидролиз гликозидных соединений. Изучаются и применяются они давно. В эту группу входят амилолитические ферменты, гидролизующие крахмал: α- и β-амилазы и глюкоамилаза. Эти гидролазы в зависимости от происхождения (животные, растения, грибы, бактерии) различаются по строению, молекулярным массам, термостабильности, оптимуму рН и другим свойствам. Многие микроорганизмы образуют α-амилазу (1,4-α-D-глюканглюканогидролазу), гидролизующую внутренние α-1,4-глюкозидные связи в амилазе и амилопектине с образованием мальтозы, декстранов и небольшого количества глюкозы. Синтез β-амилазы у микроорганизмов наблюдается реже.

Продуцентами α-амилазы, применяемыми в практических целях, являются Bacillus licheniformis, Вас. amyloliquefaciens, Aspergiellus oryzae и некоторые другие микроорганизмы. Интересен тот факт, что α-амилаза Вас. licheniformis обладает очень высокой термоустойчивостью и способна гидролизовать крахмал при температуре около 100°С.

Широко представлена, в основном у грибов, глюкоамилаза (1,4- α-D-глюкан-глюканогидролаза). У Asp. niger она состоит из двух глюкопротеинов с молекулярной массой около 100000 дальтон.

Декстраназа (1,6- α-D-глюкан-глюканогидролаза) воздействует на 1,6-глюкозидные связи в декстране. В большом количестве ее образуют Penicillium purpurogenium и некоторые другие грибы этого рода.

Фермент пуллуланаза (пуллулан-6-глюканогидролаза) гидролизует грибной полисахарид пуллулан, а также гликоген, аминопектин и декстрины, последние образуются из амилопектина и гликогена. Интересно, что фермент пуллуланаза получают из грамотрицательной бактерии Klebsiella pneumoniae, редко используемой в качестве продуцента ферментов.

Лактаза или β-галактозидаза (β -D-галактозид-галактогидролаза) превращает лактазу в глюкозу и галактозу. Продуцируют фермент Е. coli, Asp. niger, Saccharomyces cerevisiae, Curvularia inaqualis, Alternaria tenuis и некоторые другие микроорганизмы.

Инвертаза (β-D-фруктофуранозид-фруктогидролаза) расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу. Образуют ее многие представители рода Aspergillus (Asp. awamori, Asp. batatae, Asp. niger), дрожжи, а также отдельные штаммы Bacillus subtilis и Вас. diastaticus.

Целлюлолитические ферменты (целлюлазы) - сложный комплекс активных белков, действующих на различные участки молекул целлюлозы. С₁-компонент (экзонуклеаза) действует на нативную целлюлозу (хлопок, фильтровальная бумага); С_x-компонент (эндонуклеаза) гидролизует клетчатку, переведенную в растворимую форму (карбоксиметилцеллюлозу). Вместе с целлюлазами микроорганизмы продуцируют целлобиазу (β-глюкозидаза), гидролизующую целлобиозу, и гемицеллюлазу, действующую на гемицеллюлозу. В конечном счете гидролиз целлюлозы приводит к образованию глюкозы.

Выпускаемые промышленностью препараты целлюлолитических ферментов обычно обладают активностью С, и С_x, а также целлобиазной и гемицеллюлазной активностями; эти препараты стабильны в широком диапазоне рН (от 3,0 до 8,0). Продуцентами целлюлаз являются многие мицелиальные грибы, в том числе Penicillium notatum, P. variabile, P. iriense, Trichoderma roseum, Verticillium alboatrum и др. Продуцируют целлюлазы и некоторые бактерии, но их свойства изучены мало.

Значительное число микроорганизмов образуют ферменты, разлагающие пектины. Пектины (полигалактурониды) состоят из остатков D-галактуроновых кислот, соединенных α-1,4-глюкозидными связями. Карбоксильные группы галактуроновой кислоты могут быть полностью или частично этерифицированы метанолом.

Пектолитические ферменты образуют комплексы, отдельные компоненты которых расщепляют молекулу пектина в различных местах. Пектиназы (полигалактуроназы) широко распространены у микроорганизмов (грибов и бактерий); у растений они встречаются редко.

Известны ферменты, осуществляющие негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойной связи в галактуроновом остатке между С₄ и C₅. Грибные пектолитические ферменты имеют оптимум рН от 3,5 до 5,0; они более стабильны. Некоторые фитопатогенные грибы обладают высокоактивным пектолитическим комплексом ферментов (Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum forma lycopersici), обусловливающим их патогенность. Фитопатогенные виды Erwinia вызывают распад тканей ряда растений благодаря высокой активности пектинолитических ферментов.

Анаэробная бактерия Clostridium felsineum продуцирует пектатрансэлиминазу, полигалактуроназу и пектинэстеразу. Четыре пектинолитических фермента обнаружены у факультативного анаэроба Bacillus polymyxa. Они характеризуются различными значениями оптимума рН и дают различные продукты гидролиза.

Протеиназы

Протеиназы, или протеазы (пептид-пептид-гидролазы), катализируют разрыв пептидных связей белков с образованием свободных аминокислот, ди- и полипептидов. Таких ферментов очень много. Некоторые из них получены в кристаллическом состоянии. По своим свойствам протеиназы микрорганизмов могут существенно различаться. Они бывают нейтральными (у Вас. subtilis, Asp. terricola), кислыми (Asp. foetidus) и щелочными, т. е. активными при различных значениях рН.

Некоторые микроорганизмы обладают несколькими протеиназами. Так, Actinomyces fradiae синтезирует шесть протеиназ. Полученный при использовании этого микроорганизма ферментный препарат «протофрадин» содержит лейцинамино- и карбоксипептидазы, сериновые протеиназы с трипсиновой, химотрипсиновой и эластазной активностями. Из культуральной среды Act. rimosus выделен комплекс протеиназ, названный «римопротелином», а из Streptomyces griseus - «протелин», гидролизующий казеин, эластин, обладающий трипсиновой, химотрипсиновой активностями и сходный с проназой.

Из Asp. terricola получен активный препарат протеиназы, лизирующий тромбы крови без гемолиза эритроцитов.

Одним из протеолитических ферментов, получаемых в промышленных количествах, является коллагеназа Clostridium histolyticum. Субстратом коллагеназы служат коллаген-белковая основа коллагеновых волокон соединительной ткани (сухожилия, сетчатый слой кожи, хрящи, связки). Пепсин, химотрипсин, трипсин, проназа отщепляют концевые пептидные группы коллагена, но не действуют на нативный коллаген.

Коллагеназа Cl. histolitycum действует на коллагены различного происхождения (шкуры животных, плавательные пузыри рыб и др.) с образованием различных продуктов, преимущественно пептидов с молекулярной массой около 500. Два трипептида доминируют в продуктах гидролиза: глицил-пролил-аланин и глицил-гистидин-пролин. Ряд грибов и Вас. subtilis образуют протеиназы, похожие на ренин животных.

Аспартаза (L-аспартат-NH₃-лиаза) осуществляет разложение аспарагиновой кислоты и активно проводит ее синтез из фумаровой кислоты и аммиака. Продуцируют этот фермент Е. coli и ряд других бактерий.

Практический интерес представляют декарбоксилазы аминокислот, образуемые рядом бактерий, в частности фермент, действующий на лизин (L-лизин-карбоксилиаза).